特应性皮炎患儿与正常儿童肠道菌群差异性研究

罗瑞静 刘杰 彭勇 王英杰 武宗琴 姜珠倩 李淑 柴维汉 李斌

1上海市嘉定区中医医院皮肤科 201899；2上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院皮肤科 200437

特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是皮肤科常见的慢性炎症性皮肤病之一，严重影响患者生活质量［1］。其发病与遗传所致免疫紊乱、皮肤屏障功能障碍、环境因素及其交互作用密切相关，其中机体免疫功能异常被认为是发病关键机制［2］。有研究报道，肠道菌群与AD的发生及发展关系密切［3］。本研究探讨特应性皮炎患儿与正常儿童肠道菌群差异。

一、对象与方法

1.对象：2015 年 4 月至 2017 年 4 月在上海市嘉定区中医医院皮肤科门诊就诊的AD 患者。纳入标准：①符合Williams［4］诊断AD 标准；②6 ～ 12 岁儿童；③无其他皮肤疾病；④无心、肝、肾等各系统严重异常；⑤无精神疾病、残疾、智力障碍；⑥近2个月未内服过糖皮质激素或近2周内未外用过此类药品；⑦近2 周未患腹泻等肠道疾病或使用抗生素；⑧近2 周未服用含益生菌等微生物制剂。健康对照组儿童来自上海市嘉定区城中路小学和普通小学，6 ～12岁，无皮肤疾病，无过敏性鼻炎、哮喘等过敏性疾病史。

符合纳入标准的AD患儿35例，男22例，女13例，平均年龄 8.9 岁；健康对照儿童 27 例，男 17 例，女 10 例，平均年龄8.0岁。两组入选者年龄、性别差异均无统计学意义。本研究通过嘉定区中医医院医学伦理委员会批准（2014006），研究对象及监护人均签署知情同意书。

2.样本采集：取受试者粪便标本（＞1 g）存储于-20 ℃冰箱。干冰运送至上海美吉生物医药科技有限公司进行检测与测序分析。

3.DNA 提取及测序、分析：根据EZNA®soil 试剂盒（美国Omega Bio-tek 公司）说明书抽提总DNA，检测DNA 浓度和纯度，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 提取质量。采用338正向引物：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和806反向引物：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，PCR扩增细菌的16SrRNA基因V3～V4区。

4.基因测序及分析：应用上海美吉生物医药科技有限公司Illumina Miseq 测序平台对研究对象粪便细菌的16SrRNA基因V3～V4区进行高通量测序及分析。

5.统计学分析：通过I-Sanger 生物信息云平台（http：//www.i-sanger.com），应用软件：R 的stats 包和python 的scipy包进行分析。选择两组丰度排名前15 的门、属、种分别比较物种差异，采用Wilcoxon 秩和检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

二、结果

1.样本信息统计：原始序列去杂处理后，62份样本共获得2 269 944 条优化序列供后续分析，平均长度435.96 bp，其中99.95%的序列长度集中在400 ～500 bp，基本覆盖了16SrDNA V3+V4 双高变区的全长。对样本物种注释分类后，共获得1个域，16个门，30个纲，48个目，82个科，230个属，427个种，569个可操作分类单元（OTU）。

2.两组在门、属、种水平物种差异比较：两组中占优势的菌门有厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）。菌门水平，AD组拟杆菌门丰度为29.16%±19.96%，健康对照组为39.06% ± 15.98%，两组差异有统计学意义（P= 0.042）；梭杆菌门分别为 0.06% ± 0.17%、0.50% ± 1.71%（P=0.041）。见图1。在菌属水平，拟杆菌属丰度分别为23.77% ±18.08%、33.1% ±15.75%（P=0.029）。见图2。在菌种水平丰度排名前15的菌种中，两组间分布差异均无统计学意义（均P＞ 0.05）。见图3。

图1 特应性皮炎组与健康对照组肠道菌群在菌门水平丰度的比较

图2 特应性皮炎组与健康对照组肠道菌群在菌属水平丰度的比较

图3 特应性皮炎组与健康对照组肠道菌群在菌种水平丰度的比较

三、讨论

随着肠道菌群与AD的关系研究不断深入，给进一步阐明该病发病机制带来了新的方向［5］。最近开展的动物研究也提出了可以通过调节肠道菌来实现治疗的可能性［6］。本研究借助Illumina Miseq 测序平台对AD患儿与健康对照儿童粪便细菌的16SrRNA 基因V3～V4 区进行高通量测序，比较两组在门、属、种水平物种差异。

结果显示，两组在菌门水平占优势的群落有厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门，这一研究结果基本符合正常人体肠道菌群门水平构成情况［7］，但两组间肠道菌群构成存在一定差异，在菌门水平，AD 组拟杆菌门及梭杆菌门群落丰度较健康对照组降低；在菌属水平，AD 组拟杆菌属群落丰度降低；而在菌种水平，在丰度排名前15的菌种中，两组间分布差异均无统计学意义。总之，两组肠道菌群的构成及菌群相对丰度存在一定差异。

目前已有研究证实，AD患者与正常人肠道菌群存在差异，Kirjavainen等［8］发现，AD患儿哺乳期表现为革兰阳性菌减少，且断奶后该差异更加明显。Kalliomaki 等［9］发现，AD患儿粪便中梭状芽胞杆菌数较正常儿童多，而双歧杆菌数少。Watanabe等［10］发现，AD患者双歧杆菌计数低于健康对照组，葡萄球菌检出率高于正常对照组，推测肠道菌群失调可能在AD 发病和皮肤症状加重中起一定作用。Penders等［11］通过队列研究显示，在AD患儿中大肠杆菌和难辨梭状芽胞杆菌定植存在差异。Song等［12］采用16SrRNA基因检测技术检测粪便中肠道菌群，发现F 梭菌内部失衡。Suzuki等［13］发现，在生命早期机体可以通过调节肠道中双歧杆菌数量来调控白细胞介素10 进而影响AD 的发生。Nowrouzian 等［14］发现，生命早期金黄色葡萄球菌定植异常及其携带的超抗原和黏附素基因与后期发生AD相关。Lee等［15］发现，AD 患儿肠道菌群与正常人存在差异，且宏基因组分析揭示，AD患者肠道菌群中免疫发展相关的功能基因与正常人存在差异。已有研究探讨AD 患者生命早期肠道菌群变化情况，然而3岁之前肠道菌群仍处于变化阶段，易受饮食等因素影响而发生变化［16］，为此，本研究选择6 ～12岁儿童，其肠道菌群趋于稳定，比较研究价值更大。

综上，AD患儿与正常儿童肠道菌群构成及菌群相对丰度存在一定差异，但与已有研究并不完全相同，考虑可能与研究对象、检测方法、样本量、检测技术的局限性等因素相关，今后应进一步深入研究其具体作用机制。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突