城市大气细颗粒物PM2.5对人角质形成细胞屏障相关蛋白表达的影响

姚骐羽 罗阳 姚煦 刘军

1昆明医科大学影像医学系 650500；2中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病医院过敏与风湿免疫科，南京 210042；3南京大学医学院附属鼓楼医院皮肤科 210008

已有研究［1-4］证实，大气悬浮颗粒物（PM）显著增加心血管疾病、呼吸道疾病和神经毒性的风险。PM2.5是大气中直径≤2.5 μm的悬浮颗粒，由于其穿透性强，易于富集有毒金属元素而具危害性［5］。皮肤直接与外界环境接触，受到PM2.5 的影响［6］。已有研究［7］显示，PM2.5作用于角质形成细胞后，会引起皮肤屏障蛋白和炎症分子表达增高，其中的重金属发挥了重要作用。不同地区PM2.5中重金属组分不同，目前我国尚无空气污染物中PM2.5对皮肤屏障蛋白表达的影响研究。本研究分析上海市空气污染物中PM2.5 重金属组分的同时，研究PM2.5 对皮肤屏障蛋白和前炎症细胞因子表达的影响。

材料与方法

1.材料与试剂：PM2.5样本由复旦大学儿科医院周玉峰教授惠赠。RT-PCR试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒、蛋白酶抑制剂及RIPA裂解液（江苏碧云天生物技术研究所）；CCK8试剂盒（美国MedChem Express公司），ELISA检测试剂盒（北京达科为生物技术有限公司）。小鼠抗人β肌动蛋白（美国Cell Signaling Technology公司），小鼠抗人丝聚蛋白、兔抗人角蛋白14、兔抗人紧密连接蛋白1（美国Biolegend公司）。限制性角质形成细胞无血清培养基（defined keratinocyte-FSM，KC-FSM，美国Invitrogen life公司）。

2.原代角质形成细胞培养：在南京大学医学院附属鼓楼医院取5 例包皮环切术后的包皮放置于含有青链霉素的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后剪碎，置于分散酶Ⅱ中4 ℃消化过夜。分离真表皮，表皮用含乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%胰酶于孵箱内37 ℃消化10 min，含血清培养基终止消化，200 目滤网过滤，制备单细胞悬液。取约3×105细胞放入细胞培养瓶中，并加入KC-FSM培养基，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中稳定培养。培养液约每2 ～3天更换1 次。该研究经中国医学科学院皮肤病医院伦理委员批准，伦理审批号为2018快审第（KY001）号，患者均签署知情同意书。

3.细胞活性检测：角质形成细胞稳定培养传代后，将细胞接种于 96 孔板中，每孔 200 μl，37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养，待细胞生长至80%时进行以下实验。向细胞中加入0（对照组）、10、50、100和200 mg/L PM2.5，培养24 h后检测生存率，确定PM2.5 的最佳作用浓度。50 mg/L PM2.5 处理原代角质形成细胞0、3、6、9、12、18和24 h，以只加培养基的孔作为对照组，确定PM2.5 的最佳作用时间。每组实验设5 个复孔。处理结束时更换培养基，每孔加入10 μl CCK-8溶液，37 ℃孵箱培育1 h，酶标仪检测450 nm处吸光度（A值），细胞存活率=［（A实验-A空白）/（A对照-A空白）］×100%。

4.角质形成细胞释放细胞因子的检测：按上述不同浓度PM2.5刺激角质形成细胞24 h后，收集细胞培养上清液，ELISA 法检测上清液中白细胞介素1α（IL-1α）、胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）、IL-33的表达。

5.皮肤屏障蛋白mRNA和蛋白表达的检测：用TRIZOL 法和RIPA 法分别抽提上述不同浓度PM2.5 组处理24 h 时角质形成细胞的总RNA 和总蛋白质。紫外分光光度计测定RNA 浓度，BCA 试剂盒测定蛋白浓度。荧光定量PCR 检测皮肤屏障蛋白丝聚蛋白、紧密连接蛋白1及角蛋白14 mRNA表达，PCR 引物序列见表 1，mRNA 检测结果用2-△△Ct表示，其中 Ct 为循环值。△△Ct = 实验组（Ct目的基因- Ctβ肌动蛋白）- 对照 组（Ct目的基因-Ctβ肌动蛋白）。Western 印迹法分析屏障蛋白的变化，以肌动蛋白做内参，用BandScan 软件分析胶片目的基因/内参的相对灰度值。

结 果

1.PM2.5 对角质形成细胞活力的影响：CCK8法检测细胞活力显示，与对照组相比，10 mg/L PM2.5组角质形成细胞存活率无明显变化（LSD-t=0.18，P＞ 0.05），50、100、200 mg/L PM2.5 组细胞存活率均显著下降（LSD-t= 0.21、0.26、0.09，均P＜0.05）。见表2。

50 mg/L PM2.5 处理角质形成细胞不同时间的实验中，随着PM2.5 作用时间延长，生存率逐渐降低，与对照组相比，均P＜0.05。最初的3 h 内细胞死亡较快，6 h之后，细胞生存率开始稳定在一定水平，24 h 时细胞生存率为72.37% ± 3.12%。见表2。孵育时间选取24 h用于后续实验。

2.PM2.5 对皮肤屏障蛋白mRNA 和蛋白表达的影响：稳定传代的原代角质形成细胞经PM2.5刺激24 h 后，荧光定量PCR 结果见表3。不同浓度PM2.5 组丝聚蛋白mRNA 表达不同（P＜ 0.01）；与对照组相比，10 mg/L 和50 mg/L PM2.5组表达升高（LSD-t= 0.12、0.41，均P＜ 0.05），100 mg/L 和200 mg/L PM2.5 组表达下降（LSD-t=0.77、0.25，均P＜ 0.05）。此外，除10 和50 mg/L PM2.5 组间差异无统计学意义（P=0.095）外，其余各PM2.5组间差异均有统计学意义（P＜ 0.01）。

角蛋白14 mRNA 表达亦先上升后下降，差异有统计学意义（P＜ 0.01），10、50、100、200 mg/L PM2.5组与对照组相比差异均有统计学意义（LSD-t= 0.45、0.48、0.49、0.48，均P＜ 0.05）。除10 mg/L与 50 mg/L PM2.5 组及 100 mg/L 与 200 mg/L PM2.5组差异无统计学意义（P= 0.15、0.095），其余各PM2.5组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。

各组紧密连接蛋白1 mRNA 表达差异有统计学意义（P＜ 0.01），10、50、100、200 mg/L PM2.5 组均显著低于对照组（LSD-t=0.20、0.03、0.065、0.33，P＜ 0.05）。除 10 mg/L 与100、200 mg/L PM2.5 组比较差异无统计学意义（P=0.57、0.16），其余PM2.5组间差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 皮肤屏障蛋白引物序列及产物大小

Western 印迹法显示，不同浓度PM2.5 组丝聚蛋白、角蛋白14、紧密连接蛋白1 水平差异均有统计学意义（P＜ 0.01）。50、100 mg/L PM2.5 组丝聚蛋白表达高于对照组（LSD-t= 0.58、1.12，均P＜0.05），而10、200 mg/L PM2.5 组与对照组差异无统计学意义（LSD-t=0.002、0.45，P=0.95、0.053）。各PM2.5 组角蛋白14 的表达均高于对照组（LSD-t=0.42、1.24、1.04、1.30，均P＜ 0.05）。10 mg/L PM2.5组紧密连接蛋白1 表达与对照组差异无统计学意义（LSD-t=-0.02，P= 0.87），50、100、200 mg/LPM2.5组均高于对照组（LSD-t=0.22、0.27、0.54，均P＜ 0.05）。见图1、表3。

表2 原代角质形成细胞经不同浓度PM2.5处理24 h及50 mg/L PM2.5处理不同时间对细胞生存率的影响（）

表2 原代角质形成细胞经不同浓度PM2.5处理24 h及50 mg/L PM2.5处理不同时间对细胞生存率的影响（）

注：n=5。a 与对照组相比，P ＜ 0.05

PM2.5浓度0（对照组）10 mg/L 50 mg/L 100 mg/L 200 mg/L F值P值细胞存活率（%）100.00±1.16 94.15±2.14 75.89±2.65a 71.80±3.21a 67.43±1.79a 96.703＜0.05 PM2.5作用时间0（对照组）3 h 6 h 9 h 12 h 18 24细胞存活率（%）100.00±1.03 86.24±2.04a 82.02±2.24a 79.32±2.58a 75.23±1.86a 73.89±2.04a 72.37±3.12a

3.PM2.5 对角质形成细胞前炎症因子表达的影响：不同浓度PM2.5 刺激24 h 后，角质形成细胞分泌TSLP、IL-1α 和IL-33 水平均明显升高（图2）。各组TSLP 水平差异有统计学意义（F= 20.85，P＜0.01），10、50、100、200 mg/L PM2.5组均高于对照组（LSD-t= 48.83、55.90、75.83、131.73，均P＜ 0.01）。除10 mg/L与100、200 mg/L PM2.5组差异有统计学意义（均P＜ 0.01），其余各PM2.5 组间差异均无统计学意义（均P＞ 0.05）。

图1 Western印迹法检测不同浓度PM2.5处理角质形成细胞24 h对皮肤屏障蛋白表达的影响 丝聚蛋白的蛋白表达先升高后下降；各组角蛋白14 的蛋白表达均有一定升高，50 mg/L PM2.5 组角蛋白14表达水平最高；紧密连接蛋白1的蛋白表达略升高

表3 不同浓度PM2.5处理原代角质形成细胞24 h后丝聚蛋白、角蛋白14和紧密连接蛋白1 mRNA和蛋白表达水平（）

表3 不同浓度PM2.5处理原代角质形成细胞24 h后丝聚蛋白、角蛋白14和紧密连接蛋白1 mRNA和蛋白表达水平（）

注：n=3。mRNA为2-△△Ct值，蛋白表达为目的基因/肌动蛋白相对灰度值比值。a 与对照组相比，P ＜0.05

PM2.5浓度0（对照组）10 mg/L 50 mg/L 100 mg/L 200 mg/L F值P值丝聚蛋白mRNA表达1 1.27±0.15a 1.32±0.09a 0.84±0.11a 0.42±0.12a 56.47＜0.01蛋白表达1 0.99±0.15 1.61±0.18a 2.11±0.34a 1.45±0.23 23.46＜0.01角蛋白14 mRNA表达1 1.15±0.13a 1.08±0.16a 0.67±0.09a 0.74±0.11a 41.71＜0.01蛋白表达1 1.40±0.23a 2.25±0.38a 2.01±0.31a 2.30±0.41a 10.13＜0.01紧密连接蛋白1 mRNA表达1 0.67±0.20a 0.87±0.13a 0.72±0.12a 0.62±0.10a 28.44＜0.01蛋白表达1 0.92±0.19 1.21±0.17a 1.27±0.21a 1.53±0.22a 52.43＜0.01

图2 不同浓度PM2.5 对角质形成细胞前炎症因子白细胞介素1α（IL-1α）、胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）、IL-33 表达的影响 随着PM2.5浓度升高，角质形成细胞分泌的TSLP、IL-1α和IL-33均升高

各组IL-1α水平差异有统计学意义（F=11.23，P＜ 0.01）。50、100、200 mg/L PM2.5 组显著高于对照组（LSD-t= 58.93、90.7、108.23，均P＜ 0.01），而10 mg/L PM2.5 组与对照组差异无统计学意义（LSD-t=41.4，P=0.06）。10 mg/L PM2.5组与100、200 mg/L PM2.5 组差异有统计学意义（均P＜0.01），其余各PM2.5 组间差异均无统计学意义（均P＞ 0.05）。

各组IL-33 水平差异亦有统计学意义（F=48.87，P＜ 0.01），且各PM2.5 组均显著高于对照组（LSD-t=7.73、17.17、20.20、31.83，均P＜ 0.01）。50与100 mg/L PM2.5 组间差异无统计学意义（P=0.25），其余各PM2.5 组间差异均有统计学意义（均P＜ 0.01）。

PM2.5浓度与前炎症因子TSLP、IL-1α和IL-33分泌量均呈正相关（r= 0.57、0.67 和 0.91，均P＜0.05）。

讨 论

完整的皮肤屏障是抵御外界不良因素侵扰的第一道防线，其功能主要依靠角质层。角质形成细胞中与结构功能相关的蛋白包括丝聚蛋白、角蛋白14、紧密连接蛋白1等［8-9］。PM2.5表面存在的有害物质（包括重金属）可能会渗入皮肤，对包括角质形成细胞在内的活细胞有直接损伤作用［10］。Kim等［11］进行了PM2.5 对角质形成细胞转录组影响的研究，发现PM2.5 可诱导细胞压力相关系统、细胞因子和炎症分子、S100A蛋白、皮肤屏障蛋白、基质金属蛋白酶类等表达异常，其中皮肤屏障相关蛋白表达的异常主要表现为丝聚蛋白、内披蛋白、转谷氨酰胺酶3 等表达升高，及角蛋白10 和15 表达降低，而细胞因子和炎症分子表达的异常主要表现为IL-1β、IL-1α、IL-36 和趋化因子 14 等表达升高。PM2.5的水溶液中主要是各种重金属离子，不同国家和地区的大气污染物中重金属离子组分不同，其对皮肤屏障功能的影响不完全一致。我们采集了上海市城区大气污染物中PM2.5，重金属组分依次为Fe、Mg、Zn、Pb、Ca、Mn 等，与上述文献报道差异较大。

本研究发现，暴露于PM2.5不仅可降低角质形成细胞生存率，还可导致皮肤屏障有关蛋白丝聚蛋白、角蛋白14和紧密连接蛋白1的表达异常。既往研究［7］发现，仅在PM2.5浓度为100 mg/L时，丝聚蛋白的表达增加有统计学意义。我们的研究发现，在PM2.5 较低浓度时丝聚蛋白和角蛋白14 的表达增加，而在PM2.5 高浓度时其表达降低，这可能与高浓度PM2.5 使细胞活性下降有关。本研究结果提示，在低浓度PM2.5暴露下角质形成细胞中丝聚蛋白和角蛋白14表达增加，保持皮肤屏障完整性，增加皮肤渗透功能，进而起到修复皮肤屏障的作用［12］；当PM2.5 浓度持续升高，角质形成细胞存活率大大下降，皮肤屏障蛋白表达也随细胞活性的下降而下降。紧密连接蛋白1 是皮肤屏障的重要组成部分，本研究发现，紧密连接蛋白1 的表达水平亦随着PM2.5浓度的增加先升高后下降，提示高浓度PM2.5破坏了细胞之间的连接，进一步破坏了皮肤屏障的完整性。本研究还发现，PM2.5可以刺激角质形成细胞分泌前炎症细胞因子TSLP、IL-1α和IL-33，这三种细胞因子均是过敏性皮肤病（如特应性皮炎）局部皮肤炎症中重要的细胞因子，参与过敏原经皮致敏、皮肤屏障功能受损和异常T细胞免疫应答等多种生物学过程［13-14］。本研究中，高浓度PM2.5 诱导的皮肤屏障蛋白表达降低可能与这些前炎症因子表达升高相关。

综上所述，PM2.5对皮肤屏障功能产生重要影响，推测当皮肤角质形成细胞暴露于PM2.5水溶液时，首先发生前炎症细胞因子和皮肤屏障相关蛋白表达的应激性升高；但当PM2.5浓度升高到一定程度后，角质形成细胞出现活性下降，进而引起皮肤屏障相关蛋白表达降低，在炎症因子的协同作用下诱导经皮免疫的发生，加剧皮肤屏障受损的恶性循环。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突