南蛇藤提取物抑制人胃癌MGC-803细胞生长的作用机制

彭微 袁桂 刘洁 刘求梅 黄旭

412000湖南中医药高等专科学校，湖南 株洲

南蛇藤属于卫矛科南蛇藤属植物，是我国重要的药用植物，主要用于抗炎镇痛、活血消肿、祛风解毒等[1]。近年来，有关南蛇藤乙酸乙酯提取物(COE)抗肿瘤免疫机制方面的研究越来越多。大量国内外研究表明，从中药南蛇藤提取的有效成分COE 具有很好的抗肿瘤活性。它已被证实通过细胞毒作用、抑制肿瘤细胞的迁移侵袭与增殖，促进肿瘤细胞凋亡等多种机制发挥抗肿瘤作用[2]。本实验将不同浓度COE作用于胃癌细胞系MGC-803，经24 h、48 h 培养后，观察COE 对胃癌细胞生长抑制及细胞周期的影响，为COE 抑制胃癌的机制进行理论上的探索，更重要的是为开发生物利用度高的抗肿瘤新药提供理论和实验依据。

资料与方法

细胞株：人胃癌细胞系MGC-803，由中南大学湘雅医学院病理实验室传代培养。

实验试剂：①南蛇藤：西安文竹生物科技有限公司(批号071254)；②5-氟尿嘧啶：凯立德生物医药技术(上海)有限公司；③MTT：Sigma公司；④RPMI1640培养基和胎牛血清：美国GIBCO 公司；⑤二甲基亚矾：上海莼试生物技术有限公司；⑥胰蛋白酶：GIBCO 公司；⑦酶联免疫检测仪：美国宝特公司；⑧流式细胞仪：美国BD 公司；⑨CO2培养箱：美国NAU-RE公司。

实验方法：⑴药物制备：将南蛇藤茎切断，粉碎成粉，烘干(20 kg)，95%乙醇(150 L)加热回流提取3 次，3 h/次，合并回收溶剂后减压浓缩并进行真空冻干，得到COE[3]。⑵细胞培养：将人胃癌MGC-803 细胞常规培养于含有10%胎牛血清的RPMI1640 培养基中，置37℃恒温、体积分数含5%CO2饱和湿度培养箱中培养，每2～3 d 传代1 次，传代后取对数生长周期细胞进行实验。⑶实验分组：实验设空白对照组(不完全1640培养液)，南蛇藤提取物组(5、10、20、40、80、160 mg/L)，阳性对照5-FU 组(3.125、6.25、12.5、25、50、100 mg/L)。⑷MTT法检测南蛇藤对MGC-803 细胞生长抑制情况：①用胰蛋白酶将处于对数生长期细胞株MGC-803消化后计数，按5×104/mL 的细胞悬液接种于96 孔培养板中，每孔内200 μL；②培养24 h、48 h，在每个孔内加入现配置的MTT溶液5 mg/mL(20 μL)，继续培养4 h；③吸除各孔内上清液，加入DMSO(150 μL/孔)，微孔板低速振荡10 min；④选择波长450 nm，用酶标仪检测每孔吸光值(OD)；⑤计算细胞生长抑制率(IR)：IR=(1-OD 试验组/OD 对照组)×100%，根据寇氏改良法计算各组的IC50；实验重复3 次。⑸流式细胞仪检测南蛇藤对MGC-803 细胞周期的影响：①根据MTT检测实验数据，设置空白对照组、南蛇藤低剂量组(10 mg/L)、南蛇藤中剂量组(20 mg/L)、南蛇藤高剂量组(40 mg/L)和5-FU 组(6.25 mg/L)。②取对数生长期细胞MGC-803 细胞消化后，用RPMI1640培养液制成5×104/mL的细胞悬液，接种于96 孔板；③继续培养24 h、48 h，用胰蛋白酶消化，用PBS 洗涤细胞，离心处理，2 000 r/min，离心5 min，收集(1～5)×104 细胞；④4℃，避光PI 染色30 min；⑤流式细胞仪检测各组细胞周期的变化。

统计学方法：数据采用SPSS 19.0 软件处理；计量资料以(±s)表示，采用t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

COE 对MGC-803 细胞生长抑制的影响：实验发现，培养24 h 后，COE 浓度在20.0 mg/L 以上的给药试验组，细胞生长均出现不同程度的生长抑制，而且抑制率随着药物浓度和时间的增加也逐渐升高，与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.01)。5-FU 组浓度在12.5 mg/L 以上各组生长抑制率明显高于对照组；培养48 h 后，COE 浓度在10.0 mg/L 以上各组和对照组相比，吸光度值明显下降，抑制率逐渐增高，差异有统计学意义(P＜0.01)；5-FU 浓度在 6.25 mg/L 以上 ，MGC-803 细胞受到明显抑制，差异有统计学意义(P＜0.01)。通过计算：IC50(COE，24 h) =lg-1[xm-i(p-0.5)]=12.781 g/L，IC50(COE，48 h) =lg-1[xm-i(p-0.5)]=8.245 g/L。见表1。

表1 COE对MGC-803细胞增殖的影响(±s)

表1 COE对MGC-803细胞增殖的影响(±s)

注：与对照组相比，⋆P＜0.05，⋆⋆P＜0.01。

组别 质量浓度(mg/L) OD值(n=6) 抑制率(%)24 h 48 h 24 h 48 h正常组 0.623±0.071 0.573±0.24 COE组(160 mg/L) 0.180±0.042⋆⋆ 0.156±0.12⋆⋆ 71.58 74.07 COE组(80 mg/L) 0.316±0.014⋆⋆ 0.183±0.075⋆⋆ 50.27 68.16 COE组(40 mg/L) 0.435±0.056⋆⋆ 0.269±0.160⋆⋆ 30.17 53.05 COE组(20 mg/L) 0.472±0.022⋆⋆ 0.337±0.086⋆⋆ 24.23 41.19 COE组(10 mg/L) 0.502±0.017⋆⋆ 0.402±0.007⋆⋆ 19.42 29.84 COE组(5 mg/L) 0.522±0.03 0.421±0.22 16.21 26.53 5-FU组(100 mg/L) 0.278±0.08⋆⋆ 0.091±0.05⋆⋆ 55.38 84.11 5-FU组(50 mg/L) 0.421±0.085⋆⋆ 0.137±0.067⋆⋆ 32.42 76.09 5-FU组(25 mg/L) 0.456±0.038⋆⋆ 0.289±0.212⋆⋆ 26.81 49.56 5-FU组(12.5 mg/L) 0.502±0.026⋆ 0.346±0.209⋆⋆ 19.42 39.62 5-FU组(6.25 mg/L) 0.526±0.075 0.397±0.239⋆ 15.57 30.72 5-FU组(3.125 mg/L) 0.562±0.069 0.554±0.279 9.79 3.31

表2 南蛇藤对MGC-803细胞周期的影响(±s)

表2 南蛇藤对MGC-803细胞周期的影响(±s)

注：与正常细胞相比，⋆P＜0.05，⋆⋆P＜0.01。

组别 24 h G0/G1 S G2/M Control 53.23±2.78 20.46±3.95 17.03±1.23 COE(10 mg/L) 61.58±0.52⋆⋆ 19.60±7.75 15.81±7.96 COE(20 mg/L) 68.58±2.06⋆⋆ 16.52±2.50 12.81±2.88 COE(40 mg/L) 77.92±3.79⋆⋆ 13.32±2.99⋆ 8.41±4.11⋆⋆5-FU(6.25 mg/L) 61.06±1.68⋆ 27.98±5.77⋆⋆ 10.41±2.73⋆

表3 南蛇藤对MGC-803细胞周期的影响(±s)

表3 南蛇藤对MGC-803细胞周期的影响(±s)

注：与正常细胞相比，⋆P＜0.05，⋆⋆P＜0.01。

组别 48 h G0/G1 S G2/M Control 54.62±1.42 22.98±0.16 20.03±1.53 COE(10 mg/L) 58.58±1.73⋆⋆ 19.98±6.63 18.31±4.77 COE(20 mg/L) 71.58±3.01⋆⋆ 17.52±3.53 9.01±3.82⋆⋆COE(40 mg/L) 80.01±4.14⋆⋆ 7.62±1.62⋆⋆ 8.41±4.11⋆⋆5-FU(6.25 mg/L) 63.06±1.46⋆⋆ 32.91±2.71⋆⋆ 4.50±3.60⋆

COE 对MGC-803 细胞周期的影响：MGC-803 细胞经南蛇藤COE(10、20、40 mg/L)和5-FU(6.25 mg/L)处理24 h、48 h 后，细胞周期均发生了明显改变。24 h后GO/G1期细胞分别增加至(61.58±0.52)、(68.58±2.06)、(77.92±3.79)；48 h后细胞分别增加至(58.58 ± 1.73)、(71.58±3.01)、(80.01±4.14)，明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)；细胞数随着药物浓度升高而不断增多，COE 浓度低于20 mg/L 以下时，对S 期和G2/M 期细胞数影响不大，差异无统计学意义(P＞0.05)。当浓度增加到40 mg/L时，S 期和G2/M 期细胞生长明显抑制，差异有统计学意义(P＜0.01)；6.25 mg/L 5-FU溶液能使停在G0/G1期和S期的细胞所占比例增加，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。见表2～3。

讨 论

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，由于其临床症状缺乏特异性，大多数患者在诊断时已处于晚期。目前，主要的治疗手段仍然是外科治疗。中药治疗恶性肿瘤不良反应小，能提高患者生活质量，延长患者生存时间。因此，寻找低毒、高效的天然植物成分，是目前研究的主要方向。近年来国内外许多学者从调节通路、肿瘤微环境、重要蛋白的表达等多方面证实COE 具有显著的抗肿瘤活性[4]。

本实验采用MTT 比色实验法检测南蛇藤对人胃癌MGC-803 细胞生长的抑制作用。实验结果显示，COE 可呈浓度和时间依赖性抑制MGC-803 细胞的增殖，浓度在10 mg/L 以上时对MGC-803 细胞生长具有明显的抑制作用。细胞周期阻滞是药物抑制细胞增殖的重要方式之一[5]。本研究中，经10、20、40 mg/L COE作用于MGC-803，24 h、48 h 后，细胞周期的检测结果表明，COE 组G0/G1期的细胞比例显著增加，S 期和G2/M 期细胞比例降低，提示COE可以将MGC-803细胞阻滞在G0/G1期。结合细胞增殖情况分析，COE 能抑制MGC-803 细胞增殖的重要原因就是通过诱导G0/G1期细胞周期阻滞来减缓细胞的增殖速度，从而达到抑制肿瘤细胞生长的作用。5-FU是一种抑制肿瘤细胞S 期的特异性药物，转化成的细胞毒性代谢产物，抑制DNA 合成导致肿瘤细胞凋亡和周期停滞[6]。本实验结果显示，5-FU组对G0/G1期和S期细胞均有一定作用，细胞所占比例随时间增加而增加，尤其是S期增加显著。

综上所述，COE 可以抑制胃癌MGC-803 细胞增殖，其机制可能是通过阻止肿瘤细胞从G0/G1期进入S 期，从而干扰细胞的周期进程。研究COE 抑制胃癌细胞生长的机制，为COE 抗肿瘤机制提供了新的研究思路，也为其进一步的开发利用奠定了基础。