大麻二醇对高糖条件下视网膜微血管内皮细胞表达VEGF的影响及机制

张婵 谭钢

421001南华大学附属第一医院眼科1，湖南 衡阳

417000湖南省娄底市爱尔眼科2，湖南 娄底

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病最常见的并发症之一，也是糖尿病患者视力下降和失明的主要原因。血管内皮功能障碍被认为是DR发生的重要病理生理改变，包括毛细血管基底膜增厚，内皮细胞和周细胞丢失，视网膜屏障受损和渗漏，以及新生血管化[1]。在视网膜血管生成的生长因子中，血管内皮生长因子(VEGF)被认为是主要的介导因子[2]。大麻二醇(CBD)是从大麻中提取出来的一种植物大麻素。现代药理学研究显示，CBD在癌症、糖尿病、炎症和神经退行性疾病方面具有一定疗效，并且对链脲佐菌素诱导的糖尿病和血-视网膜屏障具有保护作用。本研究旨在观察CBD对HRCECs增殖及VEGF 表达的影响，并初步探索VEGF可能的调控机制。

资料与方法

细胞培养与处理：HRCECs 于含10%胎牛血清的DMEM 细胞培养基内，37℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h。细胞分为6 组：P0组(空白对照)：仅加入等体培养基；P1组(溶剂对照组)：加入0.5%乙醇作为溶剂对照；P2组(低糖对照组)+0.5%乙醇：葡萄糖的浓度为5.5 mmol/L+0.5%乙醇；P3组(高糖对照组)：葡萄糖浓度为22 mmol/L+0.5%乙醇；P4组：P3+1 μ mol/L 大 麻 二 醇(CBD)；P5组：P3+10 μmol/LCBD。

细胞增殖分析：将0.5%MTT溶液分别加入各孔，继续培养4 h后，吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO 溶解，置摇床上使结晶溶解完，上机检测，490 nm 波长，测定各孔吸光度(A)值，实验重复3次，计算细胞活力。

实时定量PCR 检测VEGF mRNA 表达：使用TRIzol 试剂提取总RNA，在20 μL反应中使用1 μg总RNA和随机六聚体进行逆转录反应，设计人VEGF 基因的引物，在实时定量PCR 仪上进行PCR。采用比较阈值循环(CT)方法，通过计算其与管家基因β-actin的比值确定相对基因表达水平。

Western blot检测VEGF蛋白表达及FOXO3a 磷酸化：用裂解缓冲液在4℃下裂解60 min 以提取细胞总蛋白。将蛋白质样品经12% SDS-PAGE 处理后，电转印至硝酸纤维素膜上，经封闭后，加入相应的一抗4℃孵育过夜，充分洗膜后加入HRP 标记的二抗室温孵育1.5 h。最后采用化学发光法显影并检测信号。

结 果

大麻二醇对高糖条件下HRCECs 增殖的影响：MTT 结果显示，在相同的时间点，高糖组细胞增殖率明显高于低糖组，并且随着时间的延长，细胞活性逐渐增高；而分别加入1 μmol/L 和10 μ mol/L CBD 处理后，与高糖组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)；且随着CBD浓度的升高，细胞活性有所降低。

大麻二醇对体外培养的HRCECs 中VEGF mRNA和蛋白表达的影响：实时定量PCR 结果显示，对P1溶剂对照组和P2低糖组细胞VEGF mRNA 表达无明显影响，而P3高糖组VEGF mRNA 表达明显增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。给予CBD 处理后，P4和P5组VEGF 表达水平明显降低。此外，Western blot 结果也显示，VEGF 蛋白表达水平与mRNA 类似。见图1。

图1 CBD对高糖条件下HRCECs中VEGF蛋白表的影响

大麻二醇对体外培养的HRCECs 中FOXO3a 磷酸化影响：Western blot 结果显示，P0空白组和P1溶剂对照组组细胞中FOXO3a 第253 位丝氨酸(Ser253)磷 酸化水平较低，P2低糖组和P3高糖组均有不同程度的增高。而加入1 μmol/L 和10 μmol/L CBD后，Ser253磷酸化水平随之减少。

讨 论

本研究采用MTT 法观察了高糖(22 mmol/L)和低糖环境下(5.5 mmol/L)HRCECs 的增殖情况，结果发现高糖环境对HRCECs 的增殖具有促进作用，与相关报道相符。VEGF 是血管内皮细胞生长的中心环节。既然高糖环境能促进HRCECs 增殖并上调VEGF 表达，那么可以通过干预VEGF 过度表达的方式间接抑制血管内皮细胞增殖，从而达到延缓PDR 的目的[3]。本研究采用高低两种剂量的CBD 作用高糖条件下的HRCECs，发现细胞的活性受到抑制。实时定量PCR 和Western blot 结果显示，CBD 处理也能下调VEGF mRNA 和蛋白的表达水平，说明土槿乙酸抑制体外HRCECs的增殖可能与下调VEGF的表达有关。FOX 蛋白是广泛参与细胞增殖分化的一类转录因子，其中以FOXO3a 最重要。本研究结果显示，空白对照组中Ser253 磷酸化水平较低，高糖条件下Ser253 磷酸化水平明显增高。但给予CBD 孵育后，Ser253 磷酸化水平明显减少。总之，本实验证实CBD 能够抑制高糖培养条件下HRCECs 的增殖，并能抑制VEGF 的表达，其机制可能与激活核转录因子FOXO3a 的活性有关。但本研究仅仅为体外实验，并且只考虑了VEGF，事实上PDR 发病机制复杂，多种发病机制相互影响，加之VEGF受多重信号通路调控，因此以上一系列问题需要进一步研究。