西昌华吸鳅的微卫星引物筛选及赤水河四个地理种群的遗传多样性分析

张 智 俞 丹 刘 飞 刘焕章

(1. 中国科学院水生生物研究所水生生物多样性与保护重点实验室, 武汉 430072; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)

西昌华吸鳅(Sinogastromyzon sichangensis)隶属于鲤形目(Cypriniformes), 爬鳅科(Balitoridae), 华吸鳅属(Sinogastromyzon), 是长江上游特有的一种小型鱼类, 主要分布于长江上游干流及部分支流[1]。赤水河为长江右岸一级支流, 流经滇、川、黔, 于四川省合江县汇入长江, 全长466 km。西昌华吸鳅是赤水河上、中游及部分支流的常见种[2], 喜急流环境, 利用腹鳍愈合成的吸盘栖息于溪流的砂石上[3]。目前, 关于西昌华吸鳅的研究报道较少, 早期多见于生物学研究[4—6]及保护生物学研究[7—10]。近年来,随着分子生物学的发展, 相关类群的系统发育研究逐渐展开[11—13], 李小娟[14]基于线粒体Cytb及核基因(EGR2、BIRBP、Zic1)对华吸鳅属鱼类物种分化进行了研究。但是西昌华吸鳅的种群遗传学研究仍然缺乏。

微卫星DNA标记由于具有共显性、高度遗传多态性和等位基因分型难度低等优点, 得到了广泛的应用, 而高多态性的微卫星位点也已成为种群遗传学研究的普遍选择[15]。本研究利用高通量测序技术共筛选出西昌华吸鳅29对具有多态性的微卫星引物, 并利用其中20对引物对赤水河4个地理种群的遗传多样性、种群分化及遗传结构进行分析,为长江上游特有鱼类的保护积累资料。

1 材料与方法

1.1 样品采集与总DNA提取

2016年5月至9月分别于赤水河源头云南水田镇(ST), 上游四川赤水镇(CSZ), 中游贵州茅台镇(MT)及赤水河支流习水河官渡镇(XS)河段采集西昌华吸鳅样本(图 1), 每个地点各取30尾西昌华吸鳅剪取背部肌肉固定于95%乙醇溶液, 保存于中国科学院水生生物研究所淡水鱼类博物馆。基因组DNA的提取采用高盐抽提法[16], 并用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量, 置于-20℃保存备用。

1.2 高通量测序、微卫星位点挖掘及筛选

使用Illumina Miseq测序仪对西昌华吸鳅一个个体的基因组DNA进行全基因组测序, 过滤掉接头、低质量序列后先进行基因组组装, 之后通过MISA软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)对微卫星位点进行搜索。选取重复类型三碱基或四碱基, 重复次数大于5且长度在70—500 bp的片段进行引物开发, 引物设计在NCBI的Primer-BLAST网页(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在线完成[17]。

随机选取8尾西昌华吸鳅个体的基因组DNA尾模板对设计的引物进行筛选并优化反应条件。PCR反应体系包括100 ng模板DNA, 10 μL 2×Master Mix (TSKINGKE), 上下游引物各1 μL并用灭菌水补充至20 μL总体系。PCR反应程序为: 95℃预变性5min; 95℃变性30s, Tm退火30s (表 1), 72℃延伸45s, 以上程序30个循环重复; 最后72℃延伸5min。反应产物采用30%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测, 经Ultra GelRed (Vazyme) 水溶液浸染后,在GeneSnap (Syngene) 紫外成像系统下拍照保存。

1.3 种群扩增与读带

选取20对多态性引物, 对赤水河4个不同地理种群的西昌华吸鳅进行扩增, 反应体系和程序同上, 利用pBR322DNA/MspⅠ和pUC18DNA/MspⅠ (Tiangen)为参照以确定不同位点等位基因大小。利用GeneSnap凝胶成像系统自动标记扩增的PCR片段并辅以人工校正, 与pBR及pUC进行比较, 最后读取不同等位基因大小。

1.4 数据处理与分析

原始数据通过CONVERT 1.31软件转化为各软件所需格式[18]。利用MICRO-CHECKER软件检查有无出现等位基因缺失、无效等位基因 (Null allele)或者由于结巴带(Shutter)引起的错配等情况[19]。通过GENEPOP检验微卫星位点是否符合哈迪温伯格平衡[20]。利用Cervus 3.03软件计算几个不同地理种群西昌华吸鳅的等位基因数(Number of alleles,Na)、观测杂合度(Observed heterozygosity,Ho)和期望杂合度(Expected heterozygosity,He)、多态信息含量(Polymorphic information content,PIC)[21]。利用Arlequin3.5软件估算几个种群的遗传分化指数(Fst)并进行分子变异分析方法(AMOVA)分析[22]。通过Structure软件对西昌华吸鳅种群结构进行分析[23, 24]。

图1 赤水河流域采样图Fig. 1 Sampling sites in Chishui River

2 结果

2.1 微卫星标记筛选

高通量测序共获得34401条存在微卫星位点的序列。在检出的微卫星序列中, 二核苷酸占优势,占全部微卫星序列的51.50%; 三核苷酸次之, 占总序列的34.54%; 其次是四核苷酸, 为6.46%; 五、六核苷酸最少, 合计占总序列的7.50%。根据微卫星位点筛选要求和引物设计原则, 共设计144对引物,其中52对引物成功扩增, 但只有29对引物显示了较高的多态性, 引物基本信息详见表 1。

表1 西昌华吸鳅微卫星位点及PCR引物信息Tab. 1 Information of polymorphic microsatellite markers of S. sichangensis

2.2 种群遗传多样性及遗传分化

选取20对多态性较高的引物对西昌华吸鳅4个地理种群进行扩增, 种群遗传多样性结果如表 2所示。西昌华吸鳅四个地理种群的等位基因数在7—28; 赤水镇种群平均观测杂合度最高, 为0.669;水田镇种群的期望杂合度最高, 为0.890; 茅台镇种群观测杂合度和期望杂合度最低, 分别为0.520和0.867; 习水河种群平均多态信息含量最高为0.868。4个种群分别有2到8个位点偏离哈迪温伯格平衡,所有地理种群西昌华吸鳅的平均多态信息含量均大于0.86, 表明西昌华吸鳅几个种群的遗传多样性处于较高水平。

表2 西昌华吸鳅4个种群微卫星标记的遗传学特征Tab. 2 Characteristics of the 20 microsatellite loci in 4 populations of S. sichangensis

对西昌华吸鳅4个地理种群进行遗传分化指数计算并进行显著性检验(表 3), 结果显示, 水田镇、赤水镇、茅台镇三个种群间无显著分化, 而习水河种群与其他3个种群均存在显著差异(Fst全部大于0.25,P＜0.01)。分子方差分析显示(表 4), 遗传变异主要来源于群体内(96.67%), 群体间的遗传变异仅为3.33%。

表3 西昌华吸鳅4个种群间的遗传分化系数Tab. 3 Pairwise Fst estimates 4 populations of S. sichangensis

表4 赤水河西昌华吸鳅分子变异分析Tab. 4 Analysis of molecular variance (AMOVA) for S.sichangensis

2.3 种群遗传结构

利用Structure软件进行种群结构分析, 计算得出K=2是比较理想的种群亚型类群数目, 即4个种群120尾西昌华吸鳅个体可分为两个亚类群, 如图 2所示, 不同灰度分别代表不同的亚类群, 其中水田镇、赤水镇及茅台镇种群的遗传背景整体趋于一致, 而习水河种群则单独聚于另外一个亚类群, 与遗传分化分析结果相一致。

3 讨论

3.1 微卫星引物筛选

传统的微卫星分离技术包括小片段DNA克隆法和微卫星富集文库法[25]。随着二代测序技术的发展, 具有通量大、成本低、周期短特点的高通量测序对基因组进行随机测序即可获得大量的微卫星序列, 相比传统方法在获取微卫星序列方面展现出了突出的优势[26,27]。特别是对于西昌华吸鳅这类DNA序列数据较为贫乏的物种, 利用高通量测序获取微卫星序列的技术难度减小且效率大幅提高。因此, 高通量测序法必将逐步取代传统方法,成为微卫星标记开发领域的主流。

图2 西昌华吸鳅种群结构分析Fig. 2 Population structure of S. sichangensis

3.2 西昌华吸鳅种群遗传学特征

生物多样性包括遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性, 其中遗传多样性既是物种多样性和生态系统多样性的基础, 也是生物多样性的核心和重要组成部分。杂合度是描述群体遗传学上的群体多态性, 当杂合度在0.5到0.8之间即可认为该群体具有较高的多样性[28]。在本研究中, 西昌华吸鳅在赤水河及其支流的4个种群的观测杂合度值均大于0.5, 表明各种群遗传多样性现状均处于较高水平。多态信息含量也是衡量基因片段多态性的理想指标, Botstein等[29]认为当PIC＞0.5时, 该位点即为高度多态位点。本实验中各种群PIC均大于0.5, 表明西昌华吸鳅各种群遗传多样性高, 说明这些种群种质资源良好, 具有一定的种群稳定性。

3.3 西昌华吸鳅种群分化与遗传特征

遗传分化指数Fst是揭示种群间遗传分化程度的重要参数。Wright[30]认为: 若种群间Fst＜0.05, 则表明种群间无分化; 若0.05＜Fst＜0.15, 则表明种群间存在中度分化; 若0.15＜Fst＜0.25, 则为高度分化。在本研究中, 赤水河干流水田、赤水镇、茅台种群间遗传分化指数均小于0.05, 表明干流种群间无显著分化; 而习水河种群与干流种群Fst均大于0.25, 存在高度分化。种群遗传结构分析结果同样与上述结果一致, 习水河种群单独聚为一个亚类群, 而干流种群遗传背景趋于一致, 聚为另一个亚类群。

西昌华吸鳅与四川华吸鳅相似, 产微黏性卵,在自然条件下常黏附于河流激流砾石滩上完成胚胎发育过程, 由于黏性较弱, 受水流冲击后常脱离基质顺水漂流[31]。习水河与赤水河交汇于赤水河下游近河口处, 与赤水河上游和中游种群难以进行基因交流, 进而逐渐分化成独立的亚群。

西昌华吸鳅是我国长江上游地区的特有类群, 具有重要的遗传价值和生态价值。近年来野外调查也发现西昌华吸鳅的种群规模呈下降趋势。因此, 在今后的管理中仍应加大赤水河水质的保护力度, 为长江上游特有水生生物资源提供良好的栖息环境。

致谢：

感谢中国科学院水生生物研究所王雪、张富斌、秦强在野外采样给予的帮助。