AI化的肿瘤液体活检研究进展

马舒婷,金 玲，谢 风

(吉林大学中日联谊医院 检验科，吉林 长春130033)

人工智能(AI)是一个基于计算机科学的类别，旨在模拟人类思维的过程、学习的能力以及知识的存储[1]。因其与医疗健康领域的融合不断加深，医疗领域的应用越来越广泛，辟如在药物的开发、医学影像的识别、智能健康管理和辅助诊断等方面。当下，肿瘤的研究和治疗正进入精准化和个体化时代，这便要依托于更好的诊断标志物和检测方法，达到提高疾病的诊断、治疗以及预测能力。在尽可能早的阶段检测出体内癌变，能够显著提高患者的治愈率和长期存活率。因液体活检具有可连续取样、自动化以及结果可重复等优势，使其得到了飞速的发展[2]。液体活检与人工智能领域能够深度融合与发展，将为临床应用带来更加广泛而深入的价值。

1 液体活检

1.1 概述

液体活检，是一种检测人体液中具有肿瘤特异性或基因特征的信息，进而对体内的肿瘤相关状态进行监测的方法。当前，组织活检被认为是癌症诊断中的金标准，但其在组织选取等多方面具有局限性，操作过程中会有增加转移的风险[3]，相比于传统的组织活检，液体活检检测方法快速、简洁，拥有微创、可重复、动态检测病情变化等特点。 2019 年 NCCN NSCLC指南(V1版)建议优先进行血液基因检测的，同时提出无组织标本时可用液体活检代替，表明液体活检的应用价值。液体活检不但包括循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)、循环肿瘤RNA(circulating RNA,ctRNA)、外泌体(extracellular vesicles,EVs)，而且也包括尿液、胸腔积液等细胞外液体的某些物质。

1.2 主要液体活检检测原理及方法

1.2.1CTCs CTCs通常是指来自肿瘤的原发性或转移性病变的癌细胞，分别为血液中的单个肿瘤细胞或几个肿瘤细胞[4]。它进入血液循环主要通过参与上皮-间质转化(EMT)[5]，使肿瘤细胞具有侵袭和迁移能力，是肿瘤血行转移的主要机制[6]。CTCs富集和分离的基本原理通常依据它们的物理性质(密度梯度离心法，过滤法等)、特异性免疫识别(免疫磁珠细胞分选)、与捕获表面的亲和力[7,8]。CTCs检测技术主要基于抗原抗体的特异性结合原理，采用各种流式细胞仪、免疫细胞化学、RT-PCR、Cell Search系统、CTCs芯片、激光扫描技术、荧光原位杂交、多肽纳米磁珠等方法，用于特定分子标志物计数或分型[9,10]。目前，CellSearch是已通过FDA认证的CTCs检测系统，具有较少干扰因素，更好的稳定性和更高的自动化程度，同时可处理多个样本[11]。也可将免疫荧光标记技术与免疫磁珠技术结合，将偶联至磁珠上的上皮细胞黏附分子抗体(EpCAM)与肿瘤细胞的表面抗原结合，用荧光标记细胞核从而实现对CTCs的富集，是目前临床上应用最广泛的方法[12]。

1.2.2ctDNA ctDNA是存在于血液中的单链或双链DNA，由肿瘤细胞的凋亡而剥落并且携带与肿瘤突变的相关表观遗传变化。ctDNA的检测有定性和定量方法，主要通过检测ctDNA的突变基因(Sanger测序、基因芯片、二代测序、BEAMing技术、CAPP-Seq技术、数字PCR等)和ctDNA甲基化(高效液相色谱法，甲基化特异性PCR，甲基化间位点扩增等)。BEAMing法已应用于临床试验，其敏感度较高，可检测到比例<1:10000的突变[13]。CAPP-Seq法通过结合RNA探针捕获技术和二代测序检测基因组的突变，从而改善测序深度，有效检出由ALK与ROS1融合的各种基因突变[14]。

1.2.3外泌体 肿瘤外泌体是纳米级的双层脂质膜结构的包裹体，直径为30-100 nm，可携带细胞特征性生物信息(蛋白质、脂质、DNA、mRNA、microRNA、Non-coding RNA等)[15]，广泛存在于各种体液中，包括血液、尿液、唾液、脑脊液、乳汁等[16]。EVs的释放主要通过向内凹陷形成多囊泡胞内体(multivesicular bodies,MVBs) 和向外出芽形成微泡(microvesicles,MVs)。其作为一种分泌微囊泡具有细胞间信息传递的功能，参与细胞迁移和通讯、免疫反应、血管新生和肿瘤细胞的生长等多种生物学行为[17]。研究表明，癌细胞比正常细胞分泌更多的外泌体，由此可获得肿瘤细胞的相关信息[18]。也有相关报道称细胞释放的 miRNA 主要存在于囊泡之中，作为一种分泌分子进而影响受体细胞表型[19,20]，或与特定的细胞表面受体结合，从而对靶细胞进行调控。现可采用离心法、色谱法以及免疫磁珠法进行分离，对于鉴定可以用电镜直接观察其形态；可依据其表面的标志物CD9及CD63等跨膜分子作为抗体与相应的抗原结合，应用 Western blot 法测其蛋白表达量；还可以使用动态光散射(DLS)、流式细胞仪(FCM)和纳米颗粒跟踪分析；PCR法和测序法被广泛应用。

1.3 液体活检在肿瘤中的应用

液体活检可应用于肿瘤的早期筛查和诊断、转移和进展、耐药性、预后评估、监测复发、微小病灶的残留、肿瘤的异质性进化以及建立基因表达谱等领域拥有技术优势和广泛的临床应用价值[21-24]。同时，液体活检可对肿瘤细胞进行动态监控，相比于一般组织活检可以更加全面地掌握疾病的实时情况以及变化过程。目前蛋白质已在临床工作中用作诊断和监测疗效的生物标志物，但其易出现假阳性的结果，有研究表明ctDNA的检测相比于蛋白质类出现假阳性的概率要低，ctDNA能反应肿瘤组织中的基因突变谱和频率，可作为疗效评价和治疗后随访的监测指标[25]。据报道，ctDNA检测是对TNM分期的补充，建议用TNMB分期替换TNM分期，添加的一个“B”即是液体活检相关信息，基于此分期系统，可以获得预后和疗效信息[26]。美国加州大学一研究组织[27]通过测定ctDNA的甲基化状态，可以确定肿瘤的起源。也可用于一些原发灶不明的癌症，判断其肿瘤发生的部位以及复发风险等。

随着精准和个体化医学的发展以及大数据的应用，基因信息监测已成为人们关注的焦点。然而，目前液体活检技术只能在一定程度上检测到肿瘤信息。由于部分肿瘤细胞具有细胞转化的能力，在其活动过程中会发生变形，部分肿瘤细胞比正常细胞小，在筛选肿瘤细胞的过程中很难有效地筛选出血液中的所有肿瘤细胞。因此，需要进一步提高肿瘤细胞的捕获技术。循环肿瘤DNA在血液里的含量也比较少，只能检测出极少部分。基于人工智能的液体活检可以很大程度上解决此类问题。

2 AI化的肿瘤液体活检

如今，大多数液体活检研究集中在晚期和转移性肿瘤患者身上，这些患者的血液释放的肿瘤细胞和核苷酸比早期癌症多，因此更容易检测到肿瘤。而一些研究者将目光投向于人工智能，开发可以帮助我们解读血中微弱信号的机器学习算法，进而对早期癌症的识别和疗效判断等方面得到帮助。人工智能网络如同人脑中的神经元，通过神经网络或者数以千计的连接点解释所得的数据。同时，随着数据的输入，机器学习算法可以自我完善和学习，以提高其诊断灵敏度。人工智能给液体活检的早期诊断和筛查提供了新的技术支持。

2.1 Freenome

Freenome的人工智能基因组学平台能够对多种物质进行分析和测序，利用人工智能的深度学习，分析基因组、蛋白质以及表观遗传学上的变化规律。该平台整合复杂的数据集，找出传统检测手段无法发现的一些隐匿性关联，从而达到对疾病的诊断和预测目的。Freenome检测血液样本中循环游离DNA(cfDNA)，当人体免疫系统对癌细胞发起攻击时，便会产生这种DNA碎片进入血液，利用AI分析大量的血液样本，从而在复杂的免疫信号与疾病间建立起关联性，利用深度学习的经验也可判断是否患癌以及肿瘤发生的部位。它针对健康人和肿瘤患者进行WGS(全基因测序)，利用基因组学和算法融合的优势，将所得数据记录到AGE(Adaptive Genomics Engine)，其分析的样本越多，辨别非癌症组与癌症组的能力越强，越能达到精准分类的目标。

2.2 GRAIL

Grail旨在在无症状肿瘤患者血液中发现其DNA，并对肿瘤进行早期筛查和诊断。为此，Grail启动了循环游离基因组图谱研究(Circulating Cell-free Genome Atlas,CCGA)临床实验项目。在ESMO(欧洲肿瘤内科学会)年会上，Grail公布了CCGA的最新相关数据，表明血液活检不仅可以用于早期筛查，而且对不同类型的肿瘤也有特异性。CCGA的第一个子研究原型测序方法包括：针对cfDNA和白细胞进行靶向配对测序，以检测单核苷酸变异、小片段的插入和(或)缺失突变；对cfDNA和白细胞进行WGS，以检测拷贝数目的变化；通过检测cfDNA甲基化的异常，从而达到cfDNA全基因组的亚硫酸氢盐测序。他们将大量的数据集输入到生物信息和机器学习算法中，以区分真正的癌症信号和大量的背景生物噪声。下一步他们还会继续优化测试系统，进而在CCGA更大的数据集中验证，随着样本量的增加，有望提高其测试性能。

2.3 FoundationOne

FoundationOne是一种癌基因检测技术，包括FoundationOne CDx、FoundationOne Heme和FoundationOne Liquid。FoundationOne CDx 是FDA批准的首个伴随诊断(Companion Diagnostics,CDx)，可对实体肿瘤进行临床分析验证，已获美国批准用于肿瘤个体化医疗。其基于二代测序，可给出基因组信号报告，包括微卫星不稳定性(MSI)和肿瘤突变负荷(tumor mutational burden,TMB)[28]。FoundationOne Liquid是基于下一代测序的混合捕获体外诊断装置。它能检测血液中置换、插入和删除的变化、拷贝数的变化和循环无细胞DNA选择性基因重排。FoundationOne Liquid 分析了70个包括同源重组缺陷(HRD)基因的已知能够促肿瘤细胞生长的基因，并给出了MSI的基因组生物标志物，可帮助后续的免疫和靶向治疗等。

2.4 Guardant360

Guardant希望利用基因组测序为患者做出诊断，并确定最佳治疗方案。Guardant360检测是通过发现血液循环中的ctDNA，通过这种微创的方式获得肿瘤相关信息，不仅可以提高诊断效率，而且可以降低诊断成本[29]。Guardant 360有73个基因经过CLIA的认证，其中包括G7生物标记物(7项指南推荐预测标记物：EGFR、ALK、ROS1、BRAF、RET、MET、ERBB2)和KRAS预后标记物。前不久公布的该产品在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中进行基因变异临床试验，结果表明，其检测结果的灵敏度与传统的组织活检相似。Guardant360发现所检测的ALK,BRAF，EGFR以及ROS1基因改变的所有阳性结果都被织活检确认了。

3 展望

肿瘤仍然是困扰着人类的一大难题，传统的组织活检虽然是临床诊断上的金标准，但也有其局限性。而液体活检具有非侵入性、可实时动态检测以及可重复性等优势，在肿瘤的早期诊断、个体化医疗以及预后判断等方面有着不可替代的价值。但因液体活检中的所检测的物质在血中含量不是很高，传统检测方法灵敏性无法完全满足，AI等技术的加入为该领域的发展带来了新的生命和希望。

随着液体活检技术的广泛开发与应用，使得液体活检数据量不断增加，大数据与人工智能技术在该领域得以发展与融合，AI化的液体活检使得资源更好地得到整合，信息得到互补，挖掘潜在的信息和模式。加之其具有深入和自主学习等特点，随着进程的不断发展，敏感性以及准确性会得到极大提升。人们因此对肿瘤的发生发展机制得以进一步深入研究，在推动促进精准医学发展上起到积极而重要的意义。现有大多数检测多关注于单一分析物质，不过在AI的帮助下，液体活检也将会进入多参数分析时代。当然，这些都要建立在临床有效性得到进一步证实之后，AI引导下的液体活检才会对肿瘤患者的临床管理上发挥其更为广泛和有效的潜力。