药物诱导玻璃体液化及后脱离的研究现状

吴煜波，王晨光，苏冠方

(吉林大学第二医院眼科中心 眼底病科,吉林 长春130041)

伴随自然科学的发展和临床研究的进步，人们发现一些玻璃体视网膜疾病与玻璃体视网膜界面的变化密切相关。年龄相关性玻璃体不完全后脱离或病理状态的玻璃体视网膜粘连会诱发玻璃体积血、黄斑前膜、黄斑裂孔、孔源性视网膜脱离等疾病。手术治疗是现阶段治疗玻璃体视网膜界面疾病的主要方法，术中力求完全切除玻璃体以解除玻璃体视网膜粘连是手术成功的关键，但玻璃体视网膜粘连紧密的病例会明显增加手术难度，且术中及术后出现出血、视网膜裂孔、视网膜脱离等并发症的几率更大[1]。近年来，已有大量关于药物诱导玻璃体液化、辅助手术产生完全性玻璃体后脱离的研究，本文将对近年诱导玻璃体液化及后脱离的药物予以综述。

1 诱导玻璃体后液化及后脱离的药物类型、机制及进展

根据药物作用机制的不同，目前诱导玻璃体液化及后脱离的药物可分为三大类，分别是单纯诱导玻璃体液化剂、玻璃体视网膜界面活性剂和兼具两种功能的药物。单纯玻璃体液化剂主要包括透明质酸酶、胶原蛋白酶，中性蛋白酶仅发现具有作用于玻璃体视网膜界面的功能，而软骨素酶、纳豆激酶、组织纤溶酶原激活物、纤溶酶在液化玻璃体的同时也可解构玻璃体视网膜界面组织[2]。

1.1 透明质酸酶(hyaluronidase)

玻璃体内的透明质酸通过结合水分子填充胶原蛋白支架结构中的空隙，防止胶原纤维间互相凝集的同时，维持着玻璃体凝胶结构的稳定性和透明度[3]。透明质酸酶可特异性地将葡萄糖胺的C1和葡萄糖醛酸的C4之间的氨基葡萄糖键断裂从而降解透明质酸，降低玻璃体的粘度。该酶在已报道的动物实验中诱导玻璃体液化的效率较低[4,5]。2004年，高度纯化的羊透明质酸酶通过了FDA的认可，一项III期实验[6]向玻璃体积血的人眼中分别注射不同浓度的羊透明质酸酶以评估该酶的效能并随访36个月，结果显示单次注射55IU羊透明质酸酶1个月后即可观察到患者积血浓度的降低和视力的提高，并可持续3个月。其注射后最常见的并发症是急性、自限性的轻中度前房炎症反应，且炎症反应的严重程度与注射浓度正相关。该酶诱导效能较低的原因可能与透明质酸酶特异性有关[7]，该酶仅作用于透明质酸分子，通过引起水分流失使玻璃体塌陷成较松弛的结构，残留的胶原蛋白等其他大分子由于缺少了彼此间透明质酸的阻挡而重新交联聚集，蛋白聚糖保持着完整性且变成了浓缩状态，最终导致玻璃体的粘附性反而增加。综上，目前的研究只能表明透明质酸酶具有良好的安全性，其诱导效能并不理想。

1.2 胶原酶(collagenase)

胶原酶是从溶组织梭状芽孢杆菌中纯化而得的一种细菌溶解酶，该酶可溶解玻璃体内的胶原蛋白。早期，人们在兔眼中应用该酶发现伴随剂量的增加，兔眼玻璃体逐渐液化，而当达到临床显著程度的液化时，兔眼出现了内界膜损伤和视网膜结构的破坏。当该酶在兔眼内超过24 h时，出现了晶状体浑浊、内界膜部分侵蚀和广泛出血的表现[8]。动物实验的结果一方面提出了胶原酶诱导玻璃体液化的可能，一方面也警示该酶潜在的或与剂量和时间正相关的毒性作用。在关于人眼的研究中，Moorhead LC[9]发现注射24U胶原酶的人眼纤维增殖膜上出现了点片状的出血点。至于该酶有效性的探索，有研究者发现胶原酶虽将玻璃体内胶原纤维消化成更小的碎片，使得玻璃体的硬度降低，但因透明质酸网络完好无损，最终结果是残存的玻璃体更粘稠，玻璃体视网膜间的粘附性可能增加了[10]。目前，某些胶原酶诱导效能低可能与该酶应用浓度有关，也可能与玻璃体自身结构有关，因玻璃体是由多种胶原蛋白构成，其中Ⅱ型、Ⅴ/Ⅺ型、Ⅵ型、Ⅸ型等胶原蛋白共同组建了玻璃体的骨架，单一胶原酶无法对所有胶原亚型有效，所以无法进入胶原蛋白交联结构的核心解构所有胶原蛋白[11]。由此可见，胶原酶尚无法成为运用于玻璃体切割手术的辅助性药物。

1.3 中性蛋白酶(dispase)

又称分散酶，是从多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)中分离出的一种中性的分子量41 kDa的蛋白酶，可选择性地分离IV型胶原和纤维连接蛋白[12]。早先，TH Tezel[13]等将不同浓度的中性蛋白酶注入离体猪眼，产生了不同程度的玻璃体后脱离，随后他们向离体人眼玻璃体注入5 U/ml的中性蛋白酶，基本上所有离体人眼都出现了完全性玻璃体后脱离的现象。进一步研究发现[14]，当在幼猪眼内成功诱导玻璃体后脱离时，一定浓度的中性蛋白酶即刻可导致视网膜前出血和类炎性免疫反应，且该酶应用的浓度越高、暴露时间越长，眼内产生视网膜内出血、晶状体半脱位等毒性作用的可能性越大。有学者[15,16]发现该酶在诱导兔眼玻璃体后脱离的过程中亦会造成不同程度的视网膜出血、白内障及前房反应，同时，伴随ERG波幅的降低，透射电镜可观察到部分视网膜超微结构的破坏。Zhu D[16]等在即将行眼球眶内摘除术的患者眼内注射了2.5IU 的中性蛋白酶，随即出现了视网膜出血的迹象，而玻璃体内仅出现了雾状混浊，他们认为该酶可能会破坏视网膜内界膜，渗透并破坏微血管壁。因此，中性蛋白酶目前仍处于动物实验阶段，其安全性及毒性作用有待进一步研究。

1.4 软骨素酶(Chondroitinase)

软骨素酶可特异性地作用于硫酸软骨素多糖(CSPGs Chondroitin sulfate proteoglycans)，多应用于治疗CSPGs增多的疾病，如脊髓损伤、瘢痕疙瘩、肿瘤等，该酶已获得美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)的批准。在玻璃体内，CSPGs存在于各型胶原蛋白间，与透明质酸等大分子结合以稳定玻璃体结构。过去的二十年，各种动物实验表明软骨素酶可活化玻璃体内的CSPGs以诱导玻璃体液化，亦可作用于玻璃体视网膜粘连紧密的区域如玻璃体基底部、视乳头，作为界面活性剂影响玻璃体视网膜界面的粘附性[17]。Bishop等[18]证实软骨素酶可在不破坏玻璃体结构的情况下显著解聚离体牛眼玻璃体内的透明质酸和硫酸软骨素，降低玻璃体的湿重。Hageman GS等[19]将20-10000IU的软骨素酶作为玻璃体切割手术的辅助剂注入食蟹猕猴眼和离体人眼，注射后5-10 min，该酶即可分离视网膜和玻璃体，且没有对内界膜产生破坏性影响。注射后14-16个月里，对食蟹猕猴眼进行观察，也未发现该酶远期副作用。然而，关于该酶有效性的报道存在不一致性，有学者分别对比了软骨素酶、纤溶酶、透明质酸酶应用于猪眼的结果，发现注射1IU软骨素酶1 h内玻璃体后脱离的效率较空白对照组没有增加,且在3种酶类中，软骨素酶液化玻璃体的效率最低[20]。目前该酶应用于人眼玻璃体的临床研究鲜有报道，其诱导效率和安全性仍需要诸多实验的评估。

1.5 纳豆激酶(Nattokinase)

纳豆激酶是由枯草杆菌产生的由275个氨基酸组成的丝氨酸蛋白酶[6]，具有强效的纤溶活性，可在抑制Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂的同时起到强化纤溶酶原激活剂的作用[21]。Takano A[22]向兔眼中分别注射不同浓度的纳豆激酶并持续观察1周发现，注射0.1FU、1FU该酶30 min后，电镜下可观察到玻璃体后脱离的出现。ERG显示0.1FU的纳豆激酶会导致1周内b波波幅短暂性降低，且组织学上未见该剂量对视网膜产生的毒性作用，然而1FU的剂量会导致不可逆的a、b波波幅的显著降低，且组织切片染色提示网膜内丛状层变薄，裂隙灯和间接检眼镜下可观察到视盘附近轻度的网膜前出血。由此，可初步认为0.1U是纳豆激酶在兔眼中应用安全且有效的浓度，鉴于该酶可成功诱导玻璃体后脱离，期待未来展开更多有关纳豆激酶的临床研究以确证其安全性。

1.6 胰蛋白酶(Trypsin)

胰蛋白酶家族最先在胰腺中被发现，起源于具有高度同源性基因的3个不同蛋白酶丝氨酸，由(胰蛋白酶1-4)4种酶组成。胰蛋白酶1具有分解I型胶原的活性，胰蛋白酶2可直接降解Ⅱ型胶原的螺旋结构。近年来，人们在玻璃体内发现了胰蛋白酶1、2，进一步的PCR分析发现，玻璃体生理性液化可能是通过视网膜小胶质细胞介导产生的胰蛋白酶2-4实现，此类酶在玻璃体液化过程中削弱了玻璃体视网膜间的粘附性[23]。向离体牛眼中注射胰蛋白酶发现玻璃体内的蛋白聚糖被分解，但较大的胶原纤维仍保持完整[7]。该酶应用于诱导玻璃体液化及后脱离的机制和可能性有待大量探索。

1.7 纤溶酶原(Plasminogen)/纤溶酶(Plasmin)

纤溶酶原是存在于血浆中的一条含有约790个氨基酸组成的单链丝氨酸蛋白酶，可在内源激活物如组织型纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，t-PA)、尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase plasminogen activator，u-PA)等或外源性激活物如链激酶(streptokinase，SK)等的作用下激活成纤溶酶。纤溶酶可降解玻璃视网膜界面的糖蛋白，如层粘连蛋白和纤维连接蛋白，还可激活玻璃体皮质内的基质金属蛋白酶，从而诱导玻璃体后脱离[24]。目前，关于该酶的研究主要分为眼内注射纤溶酶原+纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物、纤溶酶三大方向。

1.7.1纤溶酶原和(或)纤溶酶原激活物

Raczyńska D[25]等将重组组织型纤溶酶原激活物(rt-PA)注入患有玻璃体黄斑牵拉症状的人眼并持续随访6个月，发现牵拉解除率rt-PA组(33.3%)高于空白对照组(16.7%)，且rt-PA组的视力存在轻微的提高，膜厚度显著减少，除注射后导致短暂性眼压增高外未发现该药物其他副作用。Karimi S等[26]的研究结果表示向人眼注射t-PA可提高最高矫正视力、减少膜厚度，但无法诱导出完全性玻璃体后脱离。赵曦泉等[27]联合应用赖氨酸-纤溶酶原和瑞替普酶在兔眼中成功诱导出了完全性玻璃体后脱离，赖氨酸-纤溶酶原是纤溶酶原在弹性蛋白水解作用下的产物，比纤溶酶原更易激活为纤溶酶，瑞替普酶是rt-PA的一种衍生物。然而，尽管该实验结果印证了一定剂量的赖氨酸-纤溶酶原和瑞替普酶有效，但组间比较提示高浓度药量可能对视网膜产生不可逆影响，且该研究样本量较小，因此，仍需要进一步的大样本实验佐证联合应用的有效性及安全性。

1.7.2纤溶酶

近年来，临床上开展了多个关于玻璃体切割术术前或术中行玻璃体腔注射纤溶酶的研究，涵盖包括病理性和外伤性黄斑裂孔[28]、增殖性糖尿病性视网膜病变、玻璃体黄斑牵拉综合征[29]等多种疾病，结果表明该酶具有良好的诱导玻璃体液化及后脱离的效能，且电子显微镜下未发现该酶对视网膜产生显著毒性作用的证据。纤溶酶的应用多从自体纤溶酶(autologous plasmin enzyme，APE)、微纤溶酶两种类型展开。

APE来源于患者自身或母体血液，通过亲和色谱法，经浓缩、纤溶酶原激活物激活等制备而成。糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、玻璃体黄斑牵拉综合征的患者行玻璃体腔注射APE后，可出现视力提高、玻璃体后脱离等现象[30,31]。Lee[32]将APE应用于儿童玻璃体切割手术之前，发现该酶可辅助手术，提高玻璃体视网膜粘连的解除率。然而，APE的应用依然存在局限性，Matonti F认为单次注射应用SK制备的APE不足以诱发完全性玻璃体后脱离，解除玻璃体黄斑牵拉，且注射APE后可预测的诱发因素和具体机制尚不明了[33]。因此，关于APE的大样本研究有待进一步开展。同时，由于APE稳定性极差，可通过自溶或结合α2-抗纤溶酶而失活，这对其制备和保存工艺提出了巨大的挑战，尽管Alireza M[30]提出应用u-PA分离提纯APE较SK物美价廉,但其实施过程依然耗时、繁琐且昂贵，难以在临床实际中推广。

微纤溶酶的出现解决了自体纤溶酶的诸多问题，该酶分子量更小且保留着同等酶活性。Ocriplasmin属微纤溶酶,是分子量仅27.2 kDa的重组丝氨酸蛋白纤溶酶片段。2012年，FDA批准Ocriplasmin用于治疗有症状的玻璃体黄斑粘连疾病；2013年该药获得欧盟市场授权。

早期，Ⅱ期临床实验提出了Ocriplasmin的有效性与安全性，其推荐应用方式为单次注射0.125 mg。多中心、随机、双盲的Ⅲ期临床实验发现，注射该酶后6个月时，Ocriplasmin组较假注射组的玻璃体黄斑粘连缓解率、黄斑裂孔闭合率及最佳矫正视力提高≥2行的比例高，随访24个月的结果(OASIS)显示 Ocriplasmin组较假注射组的玻璃体黄斑牵拉缓解率、黄斑裂孔闭合率均高，表明Ocriplasmin在短期及中长期内均具备一定有效性[34,35]。 Jackson[36]等的研究证实，6个月时Ocriplasmin组较空白对照组视力提高20%。已报道的Ocriplasmin主要不良反应包括16.8%飞蚊症、8.2%进展性白内障、7%一过性或轻微的炎症反应，注射后视网膜脱离或视网膜撕裂的发生率与安慰剂组无明显差异[37]。2014年，医疗保险和医疗补助服务中心(Center of Medicare and Medicaid Services CMS) 比较了玻璃体切割术和玻璃体腔注射Ocriplasmin在治疗玻璃体黄斑粘连及黄斑裂孔疾病时的成本效益，推荐玻璃体切割术为治疗的首选。然而最新一项经机构审查委员会批准的单中心、多医师、长达15个月的回顾性成本效益分析表明尽管首次介入治疗的成功率玻璃体切割术较注射Ocriplasmin高，但适时地在玻璃体黄斑粘连及黄斑孔患者中应用Ocriplasmin是更高成本效益的选择[38]。

伴随Ocriplasmin的逐渐推广，其临床应用的切实效果成为人日益关注的焦点。目前，Ocriplasmin的有效性仍存在一定局限性和选择性，研究者发现Ocriplasmin注射组中28天内玻璃体黄斑粘连的缓解更易发生在<65岁、无黄斑前膜、玻璃体黄斑粘连直径≤1500 μm、有晶体眼的人群中，其中年龄<65岁的患者最佳矫正视力较年长者提高2-3行，在伴有黄斑孔的患眼中，直径≤250 μm的黄斑孔应用Ocriplasmin的闭合率更高[39]。另外，在一些特定的临床情况，如巨大黄斑裂孔、高度近视、无晶状体眼、增殖性糖尿病性视网膜等，Ocriplasmin缺乏足够的临床证据支持其可行性。同时，Ocriplasmin应用的安全性也在持续追证。Margo等[40]报道了在注射Ocriplasmin后14个月时依然存在的OCT及视网膜电图(electroretinogram,ERG)异常，表现为黄斑区视网膜下液的积聚和视杆细胞敏感性的降低。OASIS后续实验应用ERG检查了部分受试者以评估全视网膜的超微结构和功能，数据提示部分受试者注射Ocriplasmin后的第7天或第28天会出现急性一过性的全视网膜ERG≥40%基线水平的降低，然而有趣的是，出现ERG降低的受试者具有更高的玻璃体黄斑粘连分解率，且较没有发生ERG降低的受试者有更好的视觉改善，研究者们认为该种情况ERG的降低或许可能预测着玻璃体黄斑粘连的分解[41]。Schatz A的团队发现，暗适应时ERG最低刺激强度的振幅显著降低，且比明适应时下降更多，提示视杆细胞感受器可能较视锥细胞感受器更易受Ocriplasmin影响，他们分析这一改变可能与Ocriplasmin对视网膜细胞层粘连蛋白和纤维连接蛋白产生的负作用有关。然而，由于ERG属于非特异性且受多种因素如光刺激强度和持续时间等影响的诊断工具，尚无法完善评估Ocriplasmin的安全性。另外，最新的报道中有学者[42]在治疗玻璃体黄斑粘连综合征时评估了玻璃体切除术和注射Ocriplasmin这两种方法，发现注射Ocriplasmin的患者出现了最佳矫正视力的短时间降低、视网膜下液的积聚和椭圆体带完整性的丧失，而这种类似表现并未出现在玻璃体切除术治疗的患者中。在接下来的研究中，可以考虑联合对比应用Ocriplasmin前后的全视网膜ERG数据、患者视功能情况和玻璃体视网膜界面解剖层面的变化等以评估该酶的安全性并拓展该酶有效性的最佳临床应用范围。

2 总结及展望

综上所述，理想的药物诱导玻璃体液化及后脱离的确可以解除玻璃体黄斑粘连、减少或避免玻璃体切割手术并发症，但其探索过程道阻且长。由于不同药物机制不同，有研究者提出“鸡尾酒”疗法，即同时联合多种酶类诱导玻璃体液化及后脱离，但未见具有临床意义的报道。目前，玻璃体软骨素酶、纳豆激酶及胰蛋白酶停留在动物实验阶段。中性蛋白酶由于其毒性作用，关于该酶的研究似乎暂时搁置。胶原酶和透明质酸酶虽得到了安全应用于人眼的证实，但其有效浓度尚不明朗。软骨素酶虽已获得FDA批准，但近年来关于该药应用于眼科的临床有效率、市场研发及普及度等未有新突破，依然是所谓的“孤儿药”。至于纤溶酶(原)类药物，最佳纤溶酶原激活物的选择、配伍方法及浓度缺乏统一定论，自体纤溶酶稳定性的调控、应用浓度、制备工艺等仍不明确。纤溶酶，尤其是Ocriplasmin的大量临床研究给药物诱导玻璃体液化及后脱离带来了诸多希望。在未来，可继续深入探究Ocriplasmin的作用机制，着眼于明确其安全性及适应症、提高有效性、扩充该酶可应用的患者群体和病种、降低成本，进行更多关于该酶的随机、长期、多中心大样本的研究。