中药“心肌一号”在动员干细胞治疗心肌损伤过程中对炎症反应的干预

马元 屈百鸣 车贤达 徐强 俞坚武 张庆刚 王利宏 盛兰

1.浙江省人民医院 杭州 310014 2.杭州医学院附属人民医院 3.浙江大学医学院附属妇产科医院

各种原因（如急性心肌缺血）引起的心肌损伤可导致心脏结构异常和功能障碍，甚至引发患者死亡，传统的治疗方式虽能改善症状，但不能挽救坏死心肌。干细胞具有增殖能力和多向分化潜力，能够从根本上增加有功能的心肌细胞的数量，进而改善心功能，因此干细胞治疗为缺血性心脏病的治疗开辟了新的途径[1-6]。干细胞动员剂能够动员骨髓干细胞，提高外周血干细胞数量，推动干细胞向受损心肌归巢和横向分化，被称为体内自身移植。这一过程由骨髓动员、归巢、转化三个阶段组成，干细胞动员剂主要干预第一阶段。“心肌一号”是由黄芪、麦冬、茯苓、佩兰、防风、大枣共6味中药组成的经验复方，课题组前期实验中已证实其具有与干细胞动员剂粒细胞集落刺激因子相似的作用[7]，但对干细胞归巢的影响尚不明确。本研究拟探讨心肌损伤后“心肌一号”在干细胞体内自身移植第二阶段中的作用机制，即对炎症反应的干预，力求使“心肌一号”更好地应用于心肌损伤后的治疗，弥补粒细胞集落刺激因子在干细胞体内自身移植第二、三阶段中可能存在的不足。

1 材料和方法

1.1 实验动物 雄性清洁级SD大鼠30只，8周龄，体质量200～250g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[动物生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002]，由杭州师范大学实验动物中心提供，动物饲养和实验研究由杭州师范大学实验动物中心和浙江中医药大学动物实验研究中心协同完成。

1.2 药品及试剂 异丙基肾上腺素购于上海禾丰制药有限公司（批号：41160301）；中药“心肌一号”由浙江省人民医院中药房提供；基质细胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1）及其配体CX-C基序趋化因子受体4（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4） 酶联 免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测试剂盒购于ELISA Genie公司（批号：RTFI01117、RTFI01297）；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-4（interleukin-4，IL-4）、白介素-10（interleukin-10，IL-10）ELISA 试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司（批号：EK0526、EK0412、EK0406、EK0418）；SDF-1、CXCR4、TNF-α、IL-10多克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公司（批号：BA1389、PA1237、BA0131、A00021-2）。

1.3 急性心肌缺血模型的建立和分组 30只SD大鼠分别腹腔注射异丙基肾上腺素（5mg/kg），48h后随机分为治疗组、对照组、模型组3组，每组10只。模型组即刻处死后观察心肌组织，心内膜见弥散的白色点状缺血灶表示造模成功[8]。

1.4 药物处理 模型建立后，治疗组每天同一时间给予“心肌一号”14g/kg（生药量）灌胃，连续灌胃28d；对照组每天同一时间以等量0．9%氯化钠溶液灌胃。

1.5 外周血炎症及趋化因子测定 灌胃第7天和第28天采集两组大鼠尾静脉血，离心取上层血清，采用ELISA 法检测 SDF-1、CXCR4、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10水平。

1.6 心肌组织学观察 第28天尾静脉取血后，以戊巴比妥麻醉，15%氯化钾溶液静脉注射处死大鼠，使大鼠心脏处于舒张期停搏状态。2%多聚甲醛灌注后分离心脏，固定、脱水、包埋剂包埋后制成冷冻切片。HE染色后，200倍显微镜下计数单个视野中毛细血管数，每张切片选5个视野取平均值。Masson染色后，400倍显微镜下采用Image Pro Plus 6．0软件定量分析单个视野纤维化面积，每张切片选5个视野取平均值。

1.7 免疫组化分析 标本取材处理同1．6，免疫组化染色后，100倍显微镜下采用Image Pro Plus 6．0软件定量分析单个视野染色程度，以灰度值表示SDF-1、CXCR4、TNF-α、IL-10 和胶原的表达水平，每张切片选3个视野取平均值。

1.8 统计学分析 采用SPSS 14．0统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠外周血炎症及趋化因子水平比较 至灌胃28d结束，对照组大鼠死亡1只。第7天和第28天两组大鼠 TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10 水平部分太低无法测出，故未进行统计；第7天两组大鼠SDF-1、CXCR4 水平比较，差异无统计学意义（P＞0．05），第 28天治疗组SDF-1水平低于对照组、CXCR4水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0．05，P＜0．01）。见表 1。

表1 两组大鼠外周血趋化因子水平比较（x±s）Tab.1 Comparison of chemotactic factors in peripheral blood of rats in each group(±s)

表1 两组大鼠外周血趋化因子水平比较（x±s）Tab.1 Comparison of chemotactic factors in peripheral blood of rats in each group(±s)

注：与对照组比较，*P＜0．05，**P＜0．01Note：Compared with control group,*P＜0．05,**P＜0．01

第28天SDF-1（pg·mL-1） CXCR4（ng·mL-1） SDF-1（pg·mL-1） CXCR4（ng·mL-1）治疗组对照组组别 第7天images/BZ_67_1433_2810_1462_2858.png145．278±31．528 162．590±14．958 1．737±0．498 1．705±0．367 195．506±24．686*225．274±30．030 1．562±0．259**0．511±0．058

2.2 两组大鼠心肌毛细血管密度和纤维化面积比较第 28 天治疗组大鼠心肌毛细血管密度（2．76±2．471）条，与对照组（2．62±2．543）条比较，差异无统计学意义（P＞0．05）；治疗组大鼠心肌纤维化面积（1．64±1．590）×104像素小于对照组（5．12±4．963）×104像素，差异有统计学意义（P＜0．05）。见图 1、2。

图1 第28天两组大鼠心肌毛细血管密度比较（HE染色，200×）Fig．1 Comparison of myocardial capillary density in each group on the 28th day(HE stain,200×)

图2 第28天两组大鼠心肌纤维化面积比较（Masson染色，400×）Fig．2 Comparison of myocardial fibrosis area in each group on the 28th day(Masson stain,400×)

2.3 两组大鼠心肌炎症及趋化因子水平比较 第28天治疗组大鼠心肌SDF-1、CXCR4、IL-10水平高于对照组，而心肌TNF-α水平低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0．01）。见表 2、图 3。

3 讨论

表2 第28天两组大鼠心肌炎症及趋化因子免疫组化阳性面积比较（±s，像素）Tab.2 Comparison of positive area through immunohistochemical stain in myocardial inflammatory and chemotactic factors in each group on the 28th day±s,pixel)

表2 第28天两组大鼠心肌炎症及趋化因子免疫组化阳性面积比较（±s，像素）Tab.2 Comparison of positive area through immunohistochemical stain in myocardial inflammatory and chemotactic factors in each group on the 28th day±s,pixel)

注：与对照组比较，**P＜0．01Note：Compared with control group,**P＜0．01

组别 TNF-α（×103） IL-10（×104） SDF-1（×105） CXCR4（×104）治疗组对照组2．00±1．905**28．87±21．505 29．83±15．442**1．89±1．867 20．07±8．479**4．87±0．324 3．61±1．341**1．49±0．877

所有组织损伤（包括心肌损伤）后，损伤部位释放炎症因子和趋化因子[9]，这些因子对于干细胞归巢至关重要。炎症因子包括促炎因子，如TNF-α、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 等；抗炎因子，如 IL-4、IL-10等，对炎症反应起调控作用。趋化因子诱导干细胞从外周血向受损心肌迁移，主要通过SDF-1及其配体CXCR4组成的SDF-1/CXCR4轴发挥作用[10]。有些细胞因子同时具备炎症因子和趋化因子的作用，如TNF-α[11]。适当的炎症反应有利于清除坏死细胞，形成新生血管，但过度的炎症反应在加速心脏重构的同时，还会影响干细胞在受损心肌的定植，而心肌损伤常伴随免疫系统的过度激活[12-13]，导致过度的炎症反应。与此同时，抗炎治疗往往又容易抑制正常的炎症反应，同时削弱趋化作用。因此，对干细胞归巢的干预，亦即对炎症因子和趋化因子的干预。

图3 第28天两组大鼠心肌炎症及趋化因子水平比较（100×）Fig．3 Comparison of level of myocardial inflammatory factors and chemotactic factors in each group on the 28th day(100×)

“心肌一号”是由黄芪、麦冬、茯苓、佩兰、防风、大枣共6味中药组成的经验复方，具有补气升阳、利水渗湿、补中益气、活血化瘀等功效。在笔者所在科室，该药物已经被用于扩张型心肌病、心力衰竭的临床治疗，并已被临床证实能够延缓心脏扩大，提高左室射血分数。研究发现，黄芪等中药具有抑制炎症反应的作用，机制包括减轻炎症细胞浸润、调控炎症相关细胞因子、减少黏附分子表达、抑制核转录因子活性等[14-16]。笔者团队前期研究结果显示，“心肌一号”具有正向调节SDF-1/CXCR4轴的作用[17]，而且能够促进骨髓间充质干细胞生成和释放，其作用与粒细胞集落刺激因子类似[7]。因此本研究进一步考察“心肌一号”调节炎症反应的作用，探究“心肌一号”调节炎症反应的同时对趋化作用有何影响，以及以上作用在干细胞归巢、心肌修复过程中的具体体现。

一般认为，心肌损伤后炎症反应在7d内达到最强；前期研究则提示，以用药第28天作为评估“心肌一号”疗效的时间点是合适的。通过对两组大鼠第7天和第28天的外周血检测发现，炎症因子水平部分太低无法测出，故未进行统计，但观察原始数据后发现，“心肌一号”对心肌损伤后外周血炎症因子的实际影响并不大（至少不存在成倍增减的情况）。第28天治疗组外周血趋化因子SDF-1水平显著低于对照组、CXCR4显著高于对照组，故SDF-1/CXCR4总体变化可能并不大，而心肌免疫组化染色以及图像分析提示治疗组趋化因子SDF-1、CXCR4水平均显著高于对照组，这与Li等[18]研究显示的趋化因子在受损组织局部-外周血中应成梯度关系一致。免疫组化染色以及图像分析还提示，第28天治疗组促炎症因子TNF-α水平显著低于对照组，而抗炎症因子IL-10显著高于对照组，说明在受损心肌局部，促炎症因子受到抑制而抗炎症因子释放增多。组织学观察提示两组大鼠毛细血管密度差异无统计学意义，而治疗组心肌纤维化面积较对照组显著减少，与预期大致相符。

综上所述，“心肌一号”在损伤心肌局部有效抑制炎症反应，同时明显升高趋化因子浓度，作用强于外周血中，可能的机制是心肌细胞对“心肌一号”具有高度敏感性，当然也不能排除外周血容量大、细胞因子浓度低及检测方法等因素对结果造成的干扰。对于急性心肌损伤高炎症反应状态而言，“心肌一号”抑制促炎症效应、促进抗炎症效应，使心肌纤维化范围相对缩小，但促进干细胞在受损心肌定植的趋化作用反而增强，且并不影响心肌新生血管的形成，总体疗效较理想。“心肌一号”减弱炎症反应，但总体结果与炎症反应减弱-趋化作用下降、炎症反应减弱-新生血管形成减少的常规关系[12,19]不相符，这可能需要用“心肌一号”独立于炎症反应外的其他作用机制来解释。“心肌一号”最终使急性心肌损伤的炎症反应调控于一个合理水平，体现了中药复方不同药效物质群由“调”至“平”的系统效应。当然，本研究存在选取的炎症因子及趋化因子种类偏少、观察时间点偏少等不足之处，有待今后进一步研究深入探讨。