肾病Ⅰ号方对肾间质纤维化大鼠TGF-β1和CTGF表达的影响

刘张红程锦国林文博武亚丹

1.浙江中医药大学附属温州中医院 浙江,温州 325000 2.浙江省中山医院3.南京中医药大学附属泰州中医院

肾间质纤维化影响慢性肾脏疾病的进程，导致不可逆的肾功能损伤，慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）患者的预后取决于肾间质纤维化的程度[1-2]。过量的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的沉积以及成纤维细胞的增生是肾间质纤维化的主要发病机制，众多细胞因子及信号通路参与了肾间质纤维化的病理过程，其中转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）[3]、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）[4]、核转录因子及Smad通路[3]、Wnt信号通路[5]在其中起着重要作用。

CKD发病率逐年增加，目前西医对CKD的治疗主要是针对基础疾病及并发症的治疗，以延缓疾病进展。血管紧张素转化酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（angiotensinⅡ receptor antagonist/angiotensinⅡ receptor blocker，ARB）是目前公认的具有肾脏保护作用的药物，被广泛应用于CKD的治疗，但ACEI或ARB的临床应用存在局限性，对于不伴高血压的CKD患者和伴肾动脉狭窄的患者，ACEI或ARB类药物需慎用。研究证实，近年来中医药治疗CKD取得了较好疗效[6-8]。肾病Ⅰ号方是浙江中医药大学附属温州中医院程锦国教授总结长期临床经验研制出的抗肾间质纤维化基本方，具有较好的临床疗效[9-11]。前期实验已证实，肾病Ⅰ号方能下调白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）基因的表达，减少系膜细胞的增殖和纤维连接蛋白（fibronectin，FN）的分泌，抑制肾间质纤维化[10]。进一步研究发现，肾病Ⅰ号方可以通过下调肾小管上皮细胞中Wnt4和β-catenin蛋白的表达，保护肾小管，减少ECM沉积，起到抗肾间质纤维化的作用[11]。本研究以肾间质纤维化大鼠模型为对象，观察肾病Ⅰ号方对大鼠肾功能、肾间质纤维化和TGF-β1、CTGF表达的影响，进一步探讨其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 SPF级健康成年雄性SD大鼠72只，体质量（200±20）g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002]。动物饲养于温州医科大学动物实验中心[实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2015-0009]，根据实验动物护理和使用指南，分组分笼饲养，饲养环境温度（20±2）℃，相对湿度为（50±5）%。

1.2 药物与试剂 肾病Ⅰ号方（柴胡、黄芩、半夏、白芍、土茯苓、半枝莲、菝葜、漏芦等）煎剂，由浙江中医药大学饮片厂炮制中心提供，将药物加水浸泡1h，水煎2次，每次50min，取汁混合后浓缩成生药含量3g·mL-1的水煎剂；盐酸贝那普利片购于北京诺华制药有限公司（规格：10mg/片；批号：X2342）；抗 TGF-β1抗体和抗CTGF抗体购于Abcam公司（批号：ab5694、ab5097）；Masson染色试剂盒为北京索莱宝生物科技公司产品（批号：G1345）：DAB显色试剂盒、超敏二步法免疫组化检测试剂盒均购于北京中杉金桥公司（批号：ZLI-9019、PV-6001）。BX51 光学显微镜为日本Olympus公司产品；微量移液器购于德国Eppendorf公司。

1.3 造模与分组 72只大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、贝那普利组和肾病Ⅰ号方组，每组18只。模型组、贝那普利组、肾病Ⅰ号方组大鼠采用单侧输尿管结扎术造成单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO），从而建立肾间质纤维化动物模型。大鼠右侧卧位固定于手术台，剪除左侧腹部被毛，以10%水合氯醛3.5mg/kg腹腔注射麻醉，常规消毒，从背部距左侧肋脊角1.5cm处行长约1.2cm的斜向切口，逐层剪开皮肤、肌肉，开腹后暴露左侧肾脏，游离左输尿管，在输尿管上1/3处以3-0丝线双重结扎左侧输尿管，然后逐层缝合。假手术组开腹后只分离左侧输尿管，但不结扎，其余操作同其他3组。所有大鼠均造模成功，无失败或死亡。

1.4 给药 术后第2天开始灌胃给药，每日早晚各1次，共3周。假手术组和模型组以0.9%氯化钠溶液10mL/kg灌胃，贝那普利组以0.08mg·mL-1贝那普利溶液0.8mg/kg灌胃，剂量参考文献[11]；肾病Ⅰ号方组以3g·mL-1肾病Ⅰ号方水煎剂30g/kg灌胃，剂量参考文献[12]，为60kg体重正常成人每日生药剂量的10倍。

1.5 标本采集 术后第7、14、21天，各组分别随机选取6只大鼠，以10%水合氯醛3.5mg/kg腹腔注射麻醉后从腹主动脉采血，3 000r/min离心10min分离血清，使用全自动生化仪检测血肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平。并摘取左肾，剥除包膜，留取肾组织，以4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋后切片。

1.6 指标观察

1.6.1 肾间质纤维化程度观察 各组肾组织石蜡切片行常规Masson染色，光镜下观察肾小管间质的病理变化情况。200倍光镜下每张切片随机选取5个非重叠视野，避开肾小球和大血管，测量每个视野中阳性染色的面积，取其平均值，根据其所占整个视野面积的百分比评定肾间质纤维化指数。标准如下：纤维化阳性面积＜2%计0分；纤维化阳性面积2%～10%计1分；纤维化阳性面积11%～20%计2分；纤维化阳性面积21%～30%计3分；纤维化阳性面积＞30%计4分。使用Image Pro Plus图像分析软件进行图像面积分析。

1.6.2 肾间质纤维化相关因子蛋白表达检测 石蜡切片常规脱蜡水化，加入3%H2O2室温静置10min后高压热修复，山羊血清封闭液室温封闭20min，然后滴加抗 TGF-β1一抗（稀释倍数 1：200）和抗 CTGF 一抗（稀释倍数1：300），4℃过夜。根据超敏二步法免疫组化检测说明滴加二抗，室温静置15min。DAB显色、水洗、苏木素复染、脱水、透明、封片。每张切片随机选取6个非重叠视野，注意避开边缘，使用Image Pro Plus图像分析软件计算累积光密度（integrated optical density，IOD），取其平均值进行统计分析。

1.7 统计学分析 采用SPSS 17．0统计软件进行统计学分析。本研究计量资料均符合正态分布，以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t法；方差不齐时采用秩和检验。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肾功能比较 各组间比较，大鼠Scr和BUN水平存在统计学差异（P＜0．01）。与假手术组比较，其余3组大鼠Scr和BUN水平明显升高，差异具有统计学意义（P＜0．05）。与模型组比较，贝那普利组和肾病Ⅰ号方组大鼠血清 Scr和BUN水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0．05），而贝那普利组和肾病Ⅰ号方组之间差异无统计学意义（P＞0．05）。见表 1。

2.2 各组大鼠肾间质纤维化指数比较 Masson染色提示，假手术组仅微量胶原组织染成蓝色；模型组肾组织蓝染胶原组织较多，且随着时间推移，蓝染面积增大，肾间质纤维化指数增加，与假手术组比较，差异有统计学意义（P＜0．05），提示肾间质纤维化呈进行性加重。而贝那普利组和肾病Ⅰ号方组肾组织蓝染胶原组织所占面积介于模型组和假手术组之间。与模型组比较，贝那普利组和肾病Ⅰ号方组肾间质纤维化指数显著降低（P＜0．05），而贝那普利组和肾病Ⅰ号方组之间差异无统计学意义（P＞0．05）。见表 2、图 1。

表1 各组大鼠肾功能比较Tab.1 Comparison of renal function in each group

2.3 各组大鼠肾组织TGF-β1和CTGF表达比较

2.3.1 各组大鼠肾组织TGF-β1表达比较 假手术组大鼠肾组织可见微量TGF-β1表达，其余3组TGF-β1表达增强，其中贝那普利组和肾病Ⅰ号方组表达弱于模型组。与相同时点假手术组比较，其余3组大鼠肾组织 TGF-β1表达均明显增高（P＜0．05）；与相同时点模型组比较，贝那普利组和肾病Ⅰ号方组TGF-β1表达减低（P＜0．05）。贝那普利组和肾病Ⅰ号方组之间差异无统计学意义（P＞0．05）。见表 3、图 2。

表2 各组大鼠肾间质纤维化指数比较（分）Tab.2 Comparison of renal interstitial fibrosis index in each group(scores)

图1 各组大鼠肾间质纤维化情况比较（Masson染色，200×）Fig．1 Comparison of renal interstitial fibrosis in each group(Masson stain,200×)

2.3.2 各组大鼠肾组织CTGF表达比较 假手术组大鼠肾组织可见微量CTGF表达，其余3组CTGF表达增强，其中贝那普利组和肾病Ⅰ号方组表达弱于模型组。与相同时点假手术组比较，其余3组大鼠肾组织 CTGF 表达均明显增高（P＜0．05）；与相同时点模型组比较，贝那普利组和肾病Ⅰ号方组CTGF表达减低（P＜0．05）；贝那普利组和肾病Ⅰ号方组之间差异无统计学意义（P＞0．05）。见表 4、图 3。

3 讨论

肾间质纤维化是各种肾脏疾病进展到终末期的关键性进程，亦是CKD共同的病理生理特点，主要表现为系膜细胞过度增生，ECM沉积增多及成纤维细胞的异常增生，肾脏组织结构破坏和功能丧失。多种细胞因子及信号通路参与了肾间质纤维化过程，其中TGF-β1和CTGF在纤维化反应中发挥关键作用。TGF-β1一直被认为是促肾间质纤维化的关键因子之一，通过激活其下游的Smad信号通路，诱导肾间质纤维化的发生，肾间质纤维化发生和进展的全部过程都有 TGF-β1的参与[13]。研究证实，TGF-β1是肾小管上皮-间充质转分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）过程中的主要诱导因子[3]，抑制 TGF-β1的表达能够延缓肾间质纤维化的进展[14]。CTGF是基质细胞蛋白家族成员，是肾小球和肾小管间质纤维化过程中的重要细胞因子，通过促进成纤维细胞的分裂增殖、胶原的沉积等方式促进纤维化的发生发展[15]，与TGF-β1协同促进肾间质纤维化[16]。研究发现，CTGF是TGF-β1的下游信号分子，具有促纤维化作用[17]。TGF-β1可诱导血管内皮细胞、平滑肌细胞、系膜细胞、成纤维细胞、肾小管上皮细胞中的CTGF表达，CTGF又可介导TGF-β1对肾间质细胞的作用，促进细胞增殖以及ECM的合成和沉积[18]。

表3 各组大鼠肾组织TGF-β1表达比较Tab.3 Comparison of TGF-β1expression in renal tissue in each group

图2 各组大鼠肾组织TGF-β1表达水平比较（200×）Fig．2 Comparison of TGF-β1expression in renal tissue in each group(200×)

表4 各组大鼠肾组织CTGF表达比较Tab.4 Comparison of CTGF expression in renal tissue in each group

图3 各组大鼠肾组织CTGF表达水平比较（200×）Fig．3 Comparison of CTGF expression in renal tissue in each group(200×)

CKD病程中肾素-血管紧张素系统活化，参与了肾间质纤维化的进程。阻断或抑制肾素-血管紧张素系统活性目前已经成为延缓肾脏疾病进展的重要手段。ACEI或ARB可以抑制肾素-血管紧张素系统活性，通过降压及非降压作用阻断肾间质纤维化的进程。贝那普利作为ARB的一种，是目前临床常用的肾脏保护药物，它可以通过抑制血管紧张素转化酶，阻止血管紧张素Ⅱ生成，阻断肾素-血管紧张素系统活化，从而实现肾脏保护作用。但ACEI和ARB不能阻断肾素-血管紧张素系统的所有通路，对肾功能的保护作用有限，而且对于不伴高血压、4期以后的CKD患者，以及伴有肾动脉狭窄的患者，ACEI和ARB类药物属于禁用或慎用范围，其临床应用具有一定的局限性。此外ACEI和ARB类药物还存在诸多的不良反应，最常见的为顽固性干咳、过敏、胃肠道反应等，也影响了患者的治疗依从性。

肾病Ⅰ号方是程锦国教授的临床经验方，多年的临床实践证实其在治疗CKD方面有较好的疗效。程锦国教授认为CKD长期迁延不愈，其病机主要是三焦枢机不利，湿热、瘀血、毒邪壅滞三焦。肾病Ⅰ号方则是根据此病机特点研制而成的，采用小柴胡汤作为基础方，配以土茯苓、半枝莲、菝葜、漏芦等清热解毒、软坚散结的药物，疏利三焦，使三焦枢机调畅。方中小柴胡汤调畅三焦，土茯苓、半枝莲清热除湿解毒，菝葜解毒化瘀，漏芦清热解毒。现代药理学研究发现，小柴胡汤能够调节慢性肾炎患者机体免疫功能，从而改善炎症[19]。黄芩的主要成分黄芩苷能通过抑制Notch1信号通路抑制TGF-β1的表达，减轻肾间质纤维化[20]。土茯苓的主要有效成分土茯苓总黄酮能通过下调TGF-β1的表达，改善肾功能并减轻肾间质纤维化[21]。漏芦能抑制肾TGF-β1和CTGF的表达，从而保护肾功能[22]。

本课题组前期研究发现，肾病Ⅰ号方具有抗肾间质纤维化作用[9-11]，能够抑制大鼠系膜细胞增殖和FN的分泌，下调IL-6和CTGF的mRNA表达，减少肾小球系膜细胞Ⅳ型胶原的分泌，下调肾小管上皮细胞中Wnt4和β-catenin蛋白的表达，减少ECM沉积，保护肾小管。本研究建立了肾间质纤维化大鼠模型，予肾病Ⅰ号方水煎剂或贝那普利干预治疗，研究结果表明，肾病Ⅰ号方在一定程度上确实能够改善大鼠肾间质纤维化，肾病Ⅰ号方组和贝那普利组大鼠各时间点的肾功能指标、肾间质纤维化指数低于模型组，TGF-β1和CTGF表达也明显降低。与贝那普利组比较，肾病Ⅰ号方组各时点肾功能指标和肾间质纤维化指数差异均无统计学意义，TGF-β1和CTGF表达差异亦无统计学意义，说明肾病Ⅰ号方的作用与贝那普利相当。由此笔者推测，肾病Ⅰ号方能通过抑制TGF-β1及其下游信号分子CTGF的表达，减轻肾小管上皮细胞EMT，在一定程度上发挥抗肾间质纤维化作用，从而延缓CKD的疾病进程。

综上所述，本研究证实肾病Ⅰ号方具有较好的抗肾间质纤维化作用，作用与贝那普利相当，其作用机制可能与下调TGF-β1和CTGF在肾组织中的表达有关，但更详细的分子机制尚需进一步深入研究加以证实。