食品中叶酸分析方法及稳定性研究进展

康文怀　叶晓利　李慧　李巧玲　秦玲

摘 要：通过优化样品前处理体系，建立精确的叶酸分析檢测方法，对促进叶酸的多方面、深层次研究具有迫切的现实意义。

介绍了叶酸的分子结构及其主要存在形式，以及常见食品中叶酸的含量。阐述了化学法和酶解法等样品前处理方法，分析表明在测定富含淀粉、蛋白质的豆类、谷物等食品中的叶酸时，更适合采用与淀粉酶、蛋白酶等联合使用的酶解法。综述了微生物法、荧光分析法、液相色谱法等常见叶酸检测方法，指出高效液相色谱-质谱联用法可快速测定不同形式的叶酸，且具有高效、精确等特点。探讨了影响叶酸稳定性的因素，以及提高叶酸摄入量和稳定性的措施，

认为可通过在主粮作物中添加叶酸、蛋白质胶囊包裹叶酸、促进叶酸与蛋白质结合等方式来提高叶酸的摄入量及其稳定性。

关键词：食品检验学;叶酸;提取;农产品;稳定性

中图分类号：TS210.1 文献标志码：A

doi：10.7535/hbkd.2019yx05010

Advances in research on analysis methods and

stability of folic acid in food

KANG Wenhuai， YE Xiaoli， LI Hui， LI Qiaoling， QIN Ling

（School of Bioscience and Bioengineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang， Hebei 050018， China）

[WT5HZ][HJ2.4mm]Abstract：

It is urgently and practically significant to optimize the sample pretreatment， and to establish accurate detection of folic acid content in food and the presence of folic acid， in order to promote the in-depth research of various aspects of folic acid.

In the paper， the molecular structure of folic acid and its main forms， as well as the content of folic acid in common foods are introduced. The sample pretreatment methods such as chemical method and enzymatic hydrolysis method are described. It is indicated that the enzymatic hydrolysis method is more suitable for the determination of folic acid in foods such as beans and grains， so that the folic acid combined with protein， starch and the like is fully hydrolyzed by using a combination of protease and amylase. The common methods for detecting folic acid， such as microbial method， fluorescence analysis method and high performance liquid chromatography （HPLC）， are reviewed. HPLC is characterized by high efficiency and precision， especially ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry/-mass spectrometry （UPLC-MS/MS）， which can quickly determine different forms of folic acid. Factors affecting the stability of folic acid and measures to increase folic acid intake and stability are explored.

It shows that the measures to increase folic acid intake and stability includes adding folic acid in staple crops， packaging folic acid with protein capsule， facilitating the combination of folic acid and protein， etc.

Keywords：food inspection; folic acid; extraction; agricultural products; stability

叶酸（folic acid，folate，FA），化学名为蝶酰谷氨酸（pteroylglutamic acid，PGA），是蝶啶系列衍生物的总称，属于水溶性B族维生素。叶酸作为甲基供体参与了许多重要的生物化学反应过程，特别在维生素B12和维生素B6合成、修复，以及嘌呤嘧啶和甲基化DNA的合成等方面发挥着重要作用[1-3]。缺乏叶酸会引起诸多健康问题，如新生儿神经管畸形、癌症、心血管疾病、巨幼红细胞贫血、动脉硬化、急性心肌梗塞和脑中风等[4]。叶酸作为人体的必须营养成分之一，却不能在人体内合成，需通过日常饮食来摄入[2]。而日常食品中叶酸含量较低，又容易在加工过程中损失，所以，普遍存在叶酸摄入不足的问题，中国北方是叶酸的重缺乏区[4-5]。

世界卫生组织WHO建议正常成年人的每日叶酸（游离态）摄入量为200 μg，孕妇和乳母为400 μg。为提高叶酸的日常摄入量，可选用叶酸含量丰富的食物，如：绿叶蔬菜、豆类、谷类、柑橘类水果、坚果、肝脏等;也可在主粮中添加叶酸。摄入叶酸须有科学的指导，才能安全有效，这就迫切需要开展不同方向的分析方法研究，例如：分析测定各类食物中叶酸的存在形式及其含量，监测添加到谷物中的叶酸剂量是否符合标准等。鉴于食品中化学成分复杂（含大量蛋白质、淀粉、多糖等），对其中叶酸定性定量的测定难度较大;而且叶酸本身的稳定性差，容易受到光、热、pH值等因素的影响，而造成定量分析不准确。本文针对叶酸分析过程中，样品的预处理、分析方法、影响叶酸稳定性因素等方面进行综述，以期获得更高效的分析方法，为进一步开展食品中叶酸的深入研究提供参考。

1 食品中的叶酸

1.1 叶酸的结构

葉酸具有复杂的分子结构（见图1），由蝶啶（Pteridine）、对氨基苯甲酸（p-Aminobenzoate）和谷氨酸链（Glutamyl chain）3部分组成。其中：

在植物和细菌中叶酸合成步骤相同，涉及3个亚细胞结构。蝶啶在细胞质中合成，对氨基苯甲酸在

叶绿体中合成，随后二者被转入线粒体中形成二氢蝶酸，再与谷氨酸作用，逐渐形成单尾或多尾叶酸

[6]。如表1所示，依据不同的取代基—R1，—R2，可形成不同的叶酸衍生物。例如：当取代基

—R1，—R2分别是—CH3，—H时，则分子式为5-CH3H4PteGlu （5-甲基四氢叶酸），它是叶酸的主要衍生物。

1.2 常见食品中的叶酸

增加叶酸日常摄入量的途径主要包括：1）增加富含叶酸的食物比例;2）提高叶酸强化食品的供给;3）使用叶酸补充剂等。此外，美国、加拿大等发达国家已经开始执行强制性的谷物叶酸强化补充政策[6-7]。

天然叶酸存在于蔬菜、水果、谷物、豆类、乳制品等食物中，其叶酸含量见表2。由表2可知，豆类的叶酸含量最为丰富;小麦的叶酸含量较低;大部分大米的叶酸含量也较低。此外，菠菜、萝卜、青菜、芹菜等蔬菜中的叶酸含量较为丰富，是叶酸的主要膳食来源。值得注意的是，过量摄入叶酸也可能会引起健康风险，如增加前列腺癌发生的风险，掩盖维生素B12缺乏症等[8]。

2 食品中叶酸的提取

叶酸的提取是分析检测食品中叶酸的关键和前提。食品中的叶酸含量低，对化学和物理条件敏感，只有经过正确的样品前处理才能最大程度地将叶酸及其衍生物提取出来。

在叶酸提取过程中，为减少氧的影响，需添加抗氧化剂，保护叶酸免受氧化并减少叶酸衍生物之间的相互转化[10]。抗坏血酸盐作为一种抗氧化剂，常在中性或碱性条件下使用，且常与巯基乙醇或二硫苏糖醇配合使用[11]。为避免光的影响，建议采用棕色容器或包裹避光材料，以防止叶酸降解。

一般采用化学法或酶解法来提取食品中的叶酸。化学法主要利用叶酸易溶于中性或碱性溶液的特性进行提取，如热沸偏磷酸提取法[12]，常用的浸提液有磷酸缓冲液[13]、HCl和三氯乙酸溶液[14]、NaOH溶液[15]、乙酸铵（pH值为7.9）缓冲液[16]等。该方法常与加热、超声波等相结合，不仅有助于细胞溶解，还会使蛋白质变性，释放结合态叶酸。邵丽华等[13]比较了恒温水浴法和超声波振荡法的叶酸提取效果，认为恒温水浴法优于超声波振荡法。有研究者提出，加热时间不宜过长，否则会导致叶酸降解，特别是在酸性条件下，表现更为明显[17]。化学法提取叶酸，还应注意γ-谷氨酰水解酶（GGH）对聚谷氨酰叶酸的水解。该酶在植物中普遍存在，可在提取过程中将多谷氨酰基水解成单戊酰基或短链谷氨酰基形式。WANG等[16]在研究含有不同个数谷氨酸链的5-甲基四氢叶酸时，利用蒸汽处理蔬菜样品，可使GGH快速失活。

豆类、谷物等食品中富含淀粉、蛋白质等，常采用酶解法来提取其中的叶酸。酶解法就是利用蛋白酶、淀粉酶等联合处理样品，使与蛋白质、淀粉等相结合的叶酸充分水解，可使各种形式的叶酸转变成单谷氨酸叶酸或2～3个谷氨酸尾的叶酸[18-19]。HEFNI等[7]在谷物、小扁豆和豆类等研究中，比较了蛋白酶、淀粉酶等单独使用以及与多种酶联合使用的效果，发现多种酶联合使用可提高叶酸的提取率。

3 叶酸的分析检测方法

叶酸的分析检测方法很多，常见的有微生物法、荧光分析法、液相色谱法（HPLC）等。

3.1 微生物法

微生物法是应用最广的检测方法，由于叶酸也是某些微生物生长所必需的营养物质，将菌液接种至含有叶酸试样液的培养液中，培养一段时间后测定其透光率（吸光度值），可据此确定叶酸的含量。

GB 5009.211—2014《食品中叶酸的测定》[20]将鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）（ATCC 7469）作为测定用菌。目前，国外在检测蔬菜、豆类、面包等食品中的叶酸时，测定用菌也采用鼠李糖乳杆菌[21-23]。

微生物法灵敏度高、结果准确，但操作复杂、试验周期较长、菌种传代保存比较繁琐，所测定的结果为叶酸总含量，不能反映叶酸不同衍生物的细节。目前，可采用试剂盒微生物法测定叶酸，扬长避短，方便快捷。

3.2 荧光分析法

荧光分析法的原理是叶酸结构中的吡嗪-嘧啶环具有特殊的吸收光谱，在紫外线照射下产生蓝色荧光，其荧光强度和叶酸浓度成正比。叶酸本身荧光较弱，需加入某些强氧化剂（过硫酸钾（K2S2O8）、高碘酸钾（KIO4）、高锰酸钾（KMnO4）、Fenton试剂等）将其氧化，氧化后产物的荧光强度大大增加，这就是间接荧光法。

王梦等[24]以KMnO4作为氧化剂，用荧光法测定了苹果、梨、菠菜等果蔬中的叶酸含量。同时，郭秀珠等[25]和迟晓星等[26]也以KMnO4作氧化剂，先后用荧光分光光谱法和间接荧光法测定了蔬菜中的叶酸含量。苏文斌[27]则采用Fenton试剂作为氧化剂，用间接荧光法测定了果蔬中的叶酸含量，发现Fenton试剂产生的羟自由基可将叶酸氧化为蝶呤-6-羧酸，其荧光值较叶酸的荧光值大大增强。

荧光分析法具有测定快速、灵敏、选择性好、仪器简单等优点。

3.3 液相色谱法

目前，常利用液相色谱法、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）来测定食品中叶酸的含量。该方法具有结果精确、操作步骤简单、分析速度快、分离效果理想等特点。采用HPLC和LC-MS测定食品中叶酸的色谱条件，因研究对象不同、所用仪器不同，存在较大差异。色谱柱一般为C18柱，洗脱液差异较大，采用HPLC时多为乙腈和磷酸缓冲液，采用LC-MS时多为乙腈和甲酸水溶液，详情见表3。

常采用液相色谱-质谱联用法（LC-MS）分析不同形式叶酸的含量及其变化。PAWLOSKY等[34]比较了LC-MS法和微生物法之间的差异，认为LC-MS法的准确度、重复性均高于微生物法，且能测定不同形式的叶酸。同时，高效液相色谱-质谱联用法的灵敏度更高，蔡建[35]在运动饮料的叶酸研究中，通过优化LC-MS色谱条件、质谱条件、提取剂等，检出限可达到0.4 μg/kg。

3.4 其他方法

除微生物法、荧光检测法、液相色谱法用于叶酸的检测外，还有伏安法、酶联免疫反应方法（ELISA）等。

JAMALI等[37]用磷酸盐缓冲液（pH值为7.0）和2-巯基乙醇浸泡提取样品，然后以一种新型纳米合金（Pt：Co）室温离子液体RTIL修饰的碳糊电极作为高灵敏传感器，采用伏安法测定了食品中的叶酸，线性响应范围为1.0×10-7～5.0×10-4 mol/L，检出限为4.0×10-8 mol/L，并成功应用于其他食品样品中叶酸的测定。张娟等[38]利用差示脉冲溶出伏安技术和叶酸在电极表面的吸附特性，建立了测定痕量叶酸的电化学分析方法，用于小米和玉米中微量和痕量叶酸的测定，其线性范围为6.78×10-10～12.27×10-8 mol/L。

李贞[39]和李江等[40]用ELISA方法分别检测了牛奶和奶粉中的叶酸含量。李贞[39]用竞争性酶联免疫、棋盘法确定最佳抗体包被条件、封闭条件、酶标抗原浓度等，并进行了性能评价测定，此方法的最低检测限为2.22 ng/mL。李江等[40]以奶粉为试材，选择叶酸检测试剂盒，建立了一种检测奶粉中叶酸的酶联免疫分析方法。

4 叶酸的稳定性研究

4.1 影响叶酸稳定性的因素

叶酸性质不稳定，其主要影响因素包括光、热、pH值等[1，4，6]。1）光照：在对叶酸和其他3种含蝶啶的分子进行的稳态光物理研究中，测定了pH值对其荧光量子产量、寿命、发射光谱和激发光谱的影响，结果表明叶酸在酸性和碱性介质中都有非常低的荧光量子产量，但与酸性介质相比，碱性介质的荧光发射光谱呈现出与pH值相关的红移现象。众所周知，紫外光可以降解叶酸，并且纯溶液在光照条件下损失得很快。2）热效应：据报道[1，6]，正常储存条件下（20 ℃和65%的湿度），叶酸以每年1%的速度分解。在100 ℃下保存2 h，叶酸损失率为8%～25%。3）pH值：通过研究不同pH值下叶酸在水溶液中的变化发现，在pH值为1时，叶酸可完全降解;在pH值为3时，叶酸部分降解（40%～45%）;在pH值为4～12时，叶酸降解率低（10%～30%）。此外，氧、电子束等均对叶酸的稳定性有一定的影响。

4.2 提高食品中叶酸含量的措施

为确保植物性食品可以提供足够量的叶酸，许多研究者正努力寻找各种方法来提高食品中叶酸的含量。美国食品和药物管理局（FDA）规定所有富含谷物的产品都要加入叶酸[41]。玉米面粉是许多西班牙裔群体的主要食物来源，可制成各种玉米食品。玉米经过传统的研磨或烘烤等环节，被加工成玉米粉、玉米饼和薯片后，添加的叶酸仅有20%得以保留[41]。ADOLPHSON等[42]对玉米成品中叶酸在保存期内的稳定性进行了评估，认为在加工成玉米粉圆饼或其他产品前，在高温条件下长时间保持湿润的强化玉米粉，由于热化学降解作用，会造成叶酸的损失。ARIYARATHNA等[43]使用从鹰嘴豆中分离出来的蛋白质形成蛋白质胶囊，包裹叶酸形成微胶囊结构，以此来提高叶酸的热稳定性。在蛋白质基质中，通过包裹叶酸可有效防止其在储存或加工过程中被降解，并提高了其生物利用率[44]。

为提高叶酸的稳定性，PUTHUSSERI等[45]用水杨酸处理香菜叶片，观察到叶片的叶酸含量增加;

DAZ等[46]在此基础上用水杨酸处理拟南芥叶片也可使叶酸含量明显增加（约4倍），此外，还考查了与叶酸代谢途径有关的19个关键基因，其中7种用于叶酸的生物合成，7种用于分解代谢，5种用于叶酸稳定。GORELOVA等[47]在番茄果实和水稻种子中，运用代谢工程技术调控叶酸生物合成基因来增加叶酸的稳定性，但由于其产生的叶酸在植物中易降解，因此还需进一步了解叶酸的分解代谢和维护叶酸稳定的可能机制[48]。

5 结 语

叶酸分布广泛，但其含量较少，精确测定各类叶酸及其衍生物需建立完备的分析体系。

1）叶酸提取方法一般为化学法和酶解法。测定富含淀粉、蛋白质的豆类、谷物等食品中叶酸时，常采用酶解法，以尽可能将与淀粉、蛋白质等相结合的葉酸水解出来。

2）常见的叶酸检测方法有微生物法、荧光分析法、液相色谱法等。微生物法是一种传统检测方法，但具有一定的局限性，操作复杂，耗时长;荧光分析法常需要使用强氧化剂来提高其灵敏度;液相色谱法具有灵敏度高、检测准确等优点，在不同果蔬、谷物等的检测过程中得到了广泛应用。特别是LC-MS，LC-MS/MS，UPLC-MS/MS的应用，灵敏度更高，测定的叶酸衍生物种类更为丰富。

3）叶酸的性质不稳定，影响因素较多，其中光、热、pH值对叶酸稳定性的影响较大。在叶酸分析检测过程中应注意避光、添加抗氧化剂、使用碱性或中性浸提液等。人们可通过在主粮作物中添加叶酸、蛋白质胶囊包裹叶酸、促进叶酸与蛋白质结合等方式，提高叶酸的摄入量及其稳定性。

总之，由于食品成分复杂、叶酸性质不稳定，对叶酸的精确、稳定检测会比较困难。随着现代分析检测技术的不断发展，为精确检测食品中叶酸的含量以及全面确认叶酸的存在形式提供了可能。谷物、玉米、小麦等作为中国的主粮作物，是人们摄入天然叶酸的主要来源。因此，通过优化样品前处理体系，建立精确的食品中叶酸的分析检测方法，可促进对叶酸的多方面、深层次研究，具有重要的现实意义。

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