TFEB对运动中能量代谢影响的研究进展

俞 捷，温 煦

关于“自噬”自2016年获得诺贝尔奖以来，科学家围绕它继续展开了众多的研究。它是细胞内的一种代谢现象，当细胞处于压力状态时，如在饥饿、损伤等外界刺激或者细胞器出现损伤的情况下，细胞为了维持自身的稳态就会发生自噬，运动刺激也是其中的一种压力状态（Neel et al.，2013）。此前，有证据已表明，自噬与运动密切相关（钱帅伟 等，2012；Chun et al.，2017；Koo et al.，2017；Lee et al.，2018；Lenhare et al.，2017；Martin-Rincon et al.，2018；Pauly et al.，2017；Yan et al.，2017；Yuan et al.，2018；Lee et al.，2012）：力量训练能通过其介导的自噬增加骨骼肌质量和完善骨骼肌功能；耐力训练介导的自噬水平受到耐力运动所调节，也可作为补偿机制保持细胞功能，保持肌肉蛋白质量控制，进而维持有氧耐力水平和骨骼肌代谢功能稳态。另外，肌肉活动可以改善线粒体数量及功能、脂肪酸氧化和葡萄糖稳态而产生有益效果，在研究这些改变的生物学机理的实验中，科学家逐渐发现这些变化与自噬信号通路密切相关（David，2012；Rabinowitz et al.，2010）。

转录因子EB（transcription factor EB，TFEB）自2009年被发现以来，备受关注，它是自噬的最主要的调控因子，与众多代谢类相关疾病有着密不可分的联系。有研究表明，运动可以通过钙调磷酸酶介导的钙离子释放激活TFEB，从而上调自噬过程（Medina et al.，2015）。但TFEB对运动表现的综合影响及其具体机制，最近才渐渐被发现。研究发现，在骨骼肌中，TFEB不仅能调节自噬，同时与线粒体的生成、结构的改变有着密切的关系，并且还能通过调控脂质氧化和葡萄糖摄取等多个能量代谢途径，综合调控运动过程中骨骼肌细胞对葡萄糖、糖原以及脂质等能量物质的灵活使用和切换，从而使得骨骼肌细胞对能量的摄取有足够的“弹性”，影响运动训练效果和运动表现。

1 全基因组表达谱分析中TFEB与代谢的关系

全基因组表达谱分析也称基因芯片分析，是通过生物信息学分析得到特异性标记代表的基因、基因表达水平、以及样品间基因表达差异等信息。有实验利用全基因组基因表达谱分析实验对TFEB过表达和TFEB敲除（TFEBKO）小鼠的骨骼肌进行转录组分析，发现若TFEB在肌肉中过表达，能导致1 514个基因的表达上调，1 109个基因表达下调；而TFEB-KO则有496个基因增加表达，458个基因抑制表达（Mansueto et al.，2017）。进一步功能性分析表明，维持葡萄糖稳态、脂质代谢以及线粒体生成的基因出现了富集，说明，TFEB基因的过表达或缺失会影响细胞代谢相关基因的表达，提示，TFEB对这些生物过程有调控作用。

2 TFEB与骨骼肌中线粒体的生成

由于线粒体是生物进行氧化代谢并最终分解能源物质——葡萄糖、脂肪酸、氨基酸的场所，所以其在运动训练中发挥着非常重要的作用。运动训练，尤其是有氧运动能使得线粒体发生适应性改变，这点在学界已得到认可。研究认为，线粒体运动适应的分子机制主要分为线粒体代谢适应和线粒体结构变化。前者主要包括呼吸链、三羧酸循环及线粒体跨膜转运中功能蛋白和相关酶的活性改变及基因表达水平的变化等；后者涵盖了线粒体基因（mtDNA）的遗传、复制、蛋白的利用和线粒体网络结构的变化（漆正堂 等，2013）。通过对小鼠肌细胞进行研究发现，在过表达TFEB的小鼠中，线粒体的密度和体积相比正常小鼠均显著性增加，而有趣的是，TFEB-KO小鼠肌肉中的线粒体数量和大小与正常小鼠相比却没有显著变化（Mansueto et al.，2017）。此外，TFEB-KO小鼠中发现约有10%的线粒体嵴形状、基质密度和外膜形态存在异常。

定量PCR实验发现，无论是肌细胞，还是C2C12细胞中的TFEB过表达均可诱导参与线粒体生成及其相关基因的表达，其中包括过氧化物酶体增殖物激活受体α（PGC-1α）（Settembre et al.，2012）。有研究认为，运动训练可快速诱导PGC-1α基因的表达从而增加线粒体（Knutti et al.，2001）。然而也有研究显示，在一次性的运动过程中，线粒体相关基因和蛋白的表达增加要早于PGC-1α含量的改变，直到运动后的恢复期，PGC-1α的蛋白水平才出现显著性增加；然而在TFEB-KO小鼠中，运动训练对PGC-1α的蛋白表达水平影响不大，有趣的是，对抑制基因PPAR也没有产生相关影响（Mansueto et al.，2017）。在进一步研究TFEB过表达对线粒体的影响机制发现，核呼吸因子1（NRF1）、核呼吸因子2（NRF2）的表达均增强，NRF2的mRNA含量以及下游表达基因水平也明显提高（Mansueto et al.，2017）。另外，TFEB过表达也增加了线粒体中参与氧化磷酸化的酶表达水平，使得线粒体的呼吸作用得到增强，增加ATP的产生（Mansueto et al.，2017）。综上，TFEB的过表达可以增加肌肉细胞线粒体的生成及其呼吸作用，从而促进ATP的生成，而TFEB-KO则会造成相反的效果。

3 TFEB对葡萄糖代谢途径的影响

TFEB-KO不仅会影响肌细胞线粒体的生成与活性，还会影响葡萄糖转运蛋白GLUT1/4的基因表达，导致骨骼肌细胞吸收葡萄糖水平的降低，从而造成骨骼肌中糖原含量的降低（Mansueto et al.，2017）。葡萄糖转运蛋白的活性受到严格的控制，学者因此进一步检测了TFEB除了会影响GLUT1/4的表达外，是否也会影响葡萄糖消耗的相关信号通路。先前的研究已经表明，一氧化氮（NO）控制骨骼肌代谢的几个方面包括线粒体生物合成和葡萄糖摄取。骨骼肌细胞内的一氧化氮合酶（NOS）可将L-精氨酸转化为L-瓜氨酸来氧化合成NO。骨骼肌中的NOS可分为神经NOS（nNOS）、内皮NOS（eNOS）和诱导型NOS（iNOS）3种亚型（Andrew et al.，1999）。其中，nNOS是由GLUT4的腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK——能量状态的敏感感受器）依赖性调节的主要亚型（Lira et al.，2007）。在TFEB过表达的骨骼肌细胞中，nNOS转录和蛋白表达都有所增加，而TFEBKO肌肉中的nNOS表达则有所降低（Mansueto et al.，2017）。ChIP实验显示，TFEB被募集在nNOS、GLUT1和GLUT4启动子上，说明，TFEB直接调控了这3个基因的转录。相应的，nNOS的下游靶标AMPK及其标靶乙酰辅酶羧化酶（ACC）的活性（Lira et al.，2010），在过表达TFEB肌肉中显著提高。值得关注的是，在TFEB-KO小鼠肌肉中并没有发现AMPK和ACC的活性变化，故判断，TFEB对糖代谢途径也有明显的调控作用。

4 TFEB与脂类代谢

糖和脂肪都是维持运动的主要能源物质，而在长时间的耐力运动项目中，脂肪供能比例大幅度提高，成为机体的主要供能方式，它的供能效率决定了能否维持运动强度和运动时间的长短。高强度耐力运动中，骨骼肌会增加对游离脂肪酸的摄取和利用（Bradley et al.，2012）。在长时间的中等强度有氧耐力训练后，脂肪酸跨膜进入骨骼肌线粒体后被分解代谢释放能量（Van Loon et al.，2003）。脂肪细胞的代谢与脂肪生成相关基因的表达有着重要联系，也受到众多转录因子的调节。有研究发现，饥饿诱导的自噬-溶酶体途径在脂代谢中发挥着重要的作用。实验发现，TFEB能正向调节和脂类代谢相关的多种蛋白的表达，而这种作用是通过促进基因Ppargc1α的转录，增强PGC-1α表达实现的（Settembre et al.，2013a）。通过Ppargc1α，TFEB也能通过自调节正反馈回路促进自身的表达，所以，TFEB和Ppargc1a能形成一种相互的正向促进作用来调节脂类代谢。在饥饿状态下，转录机制将自噬途径与细胞能量代谢联系起来。实验发现，肝脏中的TFEB，在遗传诱导或是食物诱导的小鼠模型中均可促进肝脏的脂类代谢，从而防止代谢综合征和肥胖形成（Settembre et al.，2013a）。在后续的研究中还发现，TFEB能介导脂肪酸跨膜的白细胞分化抗原36(CD36)、脂肪酸结合蛋白(FABPs)，参与脂肪酸在线粒体中氧化分解、肉碱乙酰转移酶以及与过氧化物酶相关CYP4a（Settembre et al.，2014）。另外，TFEB过表达时能够抑制由于过度饮食或基因因素导致的肥胖（Settembre et al.，2013b）。综上所述，TFEB对脂代谢有正向调节作用。

5 TFEB在骨骼肌能量代谢中的作用

骨骼肌不但是运动最重要的应答器官，也是运动中能量代谢的场所。运动训练能诱导骨骼肌的能量代谢产生适应性变化（钱帅伟 等，2014；吴菊花，2016）。研究发现，一次性的力竭运动能导致TFEB进入细胞核，而小强度运动却没有影响，而7周非力竭的递增强度训练，可以使大量的TFEB从细胞质进入细胞核。因此，训练强度和训练时间均被认为是导致TFEB入核并参与基因调控的重要因素（Mansueto et al.，2017）。此外，在一次性的强度运动中，过表达TFEB小鼠对高强度运动有更好的适应，而TFEBKO小鼠则不能完成该强度。同时也发现，TFEB-KO小鼠在运动15 min后，呈现能量消耗显著性下降，实验证实，TFEB-KO小鼠有更高的呼吸交换率，运动后血糖含量和胰岛素水平也更低。还有实验发现，TFEB-KO小鼠的在相同强度运动下，其血乳酸含量显著高于野生型小鼠，而TFEB转基因小鼠却有着更好的运动表现和更低的血乳酸水平（Mansueto et al.，2017）。进一步的研究发现，在运动后TFEB-KO小鼠的血液游离脂肪酸浓度降低，肌肉含量降低，而脂肪酸的代谢中间物酮体却没有变化。这些发现证实了在敲除TFEB的情况下小鼠的代谢改变并迫使肌细胞使用脂质用于ATP产生，而TFEB-KO小鼠中脂质燃料的耗尽导致无法维持对照的相同运动强度。从上述实验中可知，TFEB-KO小鼠的血糖迅速消耗，本研究推测，在运动中为了供能迫使从葡萄糖供能转化为脂肪酸供能，说明，TFEB有助于骨骼肌对葡萄糖的能量转化效率，TFEB的缺乏会导致骨骼肌对能量需求更高，能量转换效能更低。而运动强度和运动量对TFEB入核并参与诱导自噬水平有重要的影响。

6 TFEB对代谢影响与骨骼肌自噬的关系

自噬与能量的再利用有着密切的关系，在增加能量需求的情况下，通过消耗能量储备，如脂质、糖原和蛋白质，自噬有助于维持能量平衡（Kim et al.，2014）。自噬过程对耐力运动有很大的帮助作用（Galluzzi et al.，2012）。此外，线粒体自噬也和运动有着明显的关系。有报道提出，运动可以通过自噬对线粒体进行调控（Lo Verso et al.，2014）。有观点认为，在维持骨骼肌稳定过程中，骨骼肌自噬和线粒体稳态和分化互相协调配合、共同作用下完成（Fortini et al.，2016）。

近期研究发现，TFEB的激活和缺失并不会对成年人的骨骼肌自噬和蛋白分解以及合成造成明显的影响（Mansueto et al.，2017）。TFEB的表达也不会诱导泛素蛋白酶体和自噬吞噬系统的大部分和萎缩相关的基因，同样的，线粒体自噬基因也没有上调表达（Mansueto et al.，2017）。研究发现，TFEB过表达小鼠的骨骼肌合成也未被提高，由于肌纤维类型从无氧类型转向了有氧类型，且骨骼肌合成未被加强诱导，所导致了肌肉横截面积也相对减少。此外，该研究没有发现过表达TFEB和肌肉之间的肌球蛋白分布有任何显著差异（Mansueto et al.，2017）。因此可以认为，TFEB直接控制骨骼肌纤维代谢，但并非是通过控制骨骼肌自噬或蛋白内稳态来实现。

7 TFEB与代谢相关通路的关系

7.1 TFEB与PGC-1α与PGC-1β

过氧化物酶体增殖物激活受体г共激活因子(PGC-1α)具有多种非常重要的生物学功能。有研究认为，PGC-1α可以促进线粒体的生成（Wen et al.，2014），也是氧化代谢的主要调节因子。急性运动、耐力运动和高强度间歇运动均可促进骨骼肌PGC-1α mRNA和蛋白表达。然而，有研究表明，运动过程中存在调节线粒体生物合成的非PGC-1α的独立途径（Rowe et al.，2012）。实验发现，在运动前，TFEB在PGC-1α KO小鼠中表达较低水平和更多细胞溶质，而运动后TFEB表达恢复正常，并引发与线粒体生物合成有关基因的上调。此外还有研究发现，对PGC-1α KO小鼠中过表达的TFEB的分析显示线粒体体积和密度增加；另外，即使在缺乏PGC-1α的情况下，TFEB过表达也可显著上调PGC-1α靶标如TFAM，NRF1和NRF2的水平；更为有趣的是，在肌肉特异性的过表达TFEB且PGC-1α KO小鼠运动耐受性得到改善；事实上，当在PGC-1α KO肌肉中表达时，TFEB表达能够恢复正常疲劳指数（Mansueto et al.，2017）。综上表明，在TFEB过度表达肌肉中诱导线粒体生物发生不依赖于PGC-1α的存在。另外，在骨骼肌中，TFEB-KO小鼠的肌肉含有比PGC-1α KO更低的糖原水平（Mansueto et al.，2017）。可以推测，TFEB独立于PGC-1α控制葡萄糖稳态以及胰岛素敏感性。

为了确定PGC-1β是否可以补偿PGC-1α的缺失，有研究测量了TFEB过表达对沉默PGC-1α和PGC-1β的细胞中线粒体生物合成的影响。重要的是，抑制两种PGC1因子都不能阻止或减少TFEB介导的与线粒体生物合成和线粒体呼吸链活性有关的基因的诱导（Mansueto et al.，2017）。

TFEB上调机制是否依赖于PGC-1α，目前科学界说法并不统一。有研究发现，亨延顿舞蹈病(Huntington disease，HD)小鼠模型中，TFEB及其靶标基因表达水平都有所下降，过表达PGC-1α可以增加TFEB的表达量，也可以缓解HD症状（Tsunemi et al.，2012）。急性运动以PGC-1α依赖性方式激发TFEB的表达和活化，并且表明，TFEB与PGC-1α均是运动后肌肉中线粒体生物发生的重要调节因子（Erlich et al.，2018）。有研究表明，长期和高强度急性运动都会对肥胖小鼠的PGC-1α增强表达（Cobley et al.，2012；Ringholm et al.，2013；Ropelle et al.，2009）。但也有研究认为，Parkin Q311X突变通过PARIS介导的PGC-1α-TFEB信号调节影响线粒体质量控制，也可以通过TFEB的上调独立恢复功能（Siddiqui et al.，2015）。就目前的研究结果而言，TFEB与PGC-1α均对运动引起的代谢变化有独立的调节作用，且两者之间也存在互相影响的关系。有可能是由于TFEB调控的基因网络具有组织特异性，在肝和肌肉细胞等不同组织中，TFEB表达了不同的特异性代谢功能。

7.2 TFEB和mTOR

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的主要功能是调节细胞生长、增殖、凋亡、自噬（韩璐 等，2013；Laplante et al.，2012）。mTOR是TFEB的上游调节因子，在正常生理状态下，磷酸化的mTOR使TFEB维持磷酸化，且定位在细胞质中处于非活跃状态，细胞的自噬也维持在基础水平。但若细胞处于饥饿或缺乏营养的环境时，mTOR则被抑制，导致TFEB去磷酸化，进入细胞核，成为活跃状态，并激活自噬。有研究发现，TFEB与mTOR复合物1（mTORC1）在溶酶体膜上共定位。当营养充足时，mTORC1磷酸化TFEB，抑制TFEB活性。相反，mTORC1 的药理学抑制、饥饿和溶酶体破坏都能通过促进其核易位来激活TFEB（Settembre et al.，2012）。有研究用疲稀土氧化物（REO）纳米颗粒处理过的细胞，使细胞空泡化诱导自噬，结果发现，mTOR失活，TFEB去磷酸化并转位进入细胞核（Lin et al.，2016）。TFEB的激活可以引起V-ATPase的表达，调节与溶酶体相关的信号通路，促进体内脂类分解（Martina et al.，2012）。

有研究发现，mTOR对能量代谢也存在一定的影响。在低脂环境下，新细胞的产生所需要的底物需要足够的脂质，此时，mTORC1能通过固醇调节元件结合蛋白（SREBP）促进脂质的合成（Peterson et al.，2011）。mTORC1也可以促进葡萄糖代谢从氧化磷酸化向糖酵解的转变，而这种转变能导致转录因子HIF1α的翻译增加，并导致糖酵解酶，如磷酸果糖激酶（PFK）的表达（Duvel et al.，2010）。在研究mTOR上游调控基因时发现，一种主要负责促进脂肪的形成与储存，调控细胞周期的基因Rheb (Ras Homolog Enriched In Brain）能激活mTORC1（Laplante et al.，2012）。

mTOR可以通过直接磷酸化TFEB调控其活性，从而影响TFEB下游的基因，也可以通过SREBP调控脂质代谢。因此，mTOR很有可能通过依赖TFEB和不依赖TFEB两种途径，调控不同环境下脂质代谢的微妙平衡。不过为验证这一可能性，还需要积累更多的实验证据来回答一系列的先决性问题，如：肌肉细胞中TFEB参与的脂质代谢调控是否同样受mTOR的影响？其他细胞中是否也是如此？TFEB与SREBP调控脂质代谢的机制之间是否相互影响？

7.3 TFEB与Bcl/ Beclin1

对于TFEB和Beclin1在代谢作用中，相互影响的研究较少，有研究证实了Bcl/Beclin1复合体能激活细胞自噬，这与TFEB的调节自噬作用类似，两者均对自噬起到重要的影响。有研究结果表明，由TFEB介导改变的自噬是ALS发病机制中的一个关键因素，TFEB通过增强Beclin-1的表达来促进自噬（Chen et al.，2015）。也有研究在模拟恶性肿瘤的自噬过程中发现，TFEB直接与自噬相关蛋白（PTEN、组织蛋白酶D、HIF1α、LC3B、Beclin 1和p62）表达相关（Giatromanolaki et al.，2014）。另外，有实验对脂肪细胞分化过程中，Beclin1蛋白水平变化和自噬活力之间的关系进行了研究（Tao et al.，2017）。谨慎来说，这些研究结果都只能证明TFEB和Bcl/Beclin1通路在自噬中的作用，两者对能量代谢的影响是否通过或者独立于自噬途径，还需要进一步研究。

8 结语

自噬对运动训练的影响已经得到广泛的关注，TFEB作为自噬的重要调控因子，也被发现能被运动训练所激活。目前研究已证实，TFEB对运动训练中骨骼肌细胞的影响不仅仅局限于对自噬的调控，还表现在对骨骼肌细胞能量代谢的综合影响。TFEB可以通过调节线粒体结构、数量，糖和脂肪的代谢以及骨骼肌对能量的利用等方面调节运动中的能量代谢，对运动训练的强度和运动训练效果起到重要的影响作用。有研究证实，运动训练对线粒体的结构和功能，脂肪酸氧化和维持葡萄糖体内平衡的有很大的作用（Hawley，2002；Holloszy et al.，1984）。而运动对TFEB的激活，也解释了运动增进健康的部分生物学原因。最近有研究揭示，TFEB对体育活动期间的代谢起到了关键作用，尤其是对骨骼肌能量代谢和耐力的综合调控，能在运动员选材、训练后的快速恢复以及营养促进策略方面提供帮助。

能量代谢对于生命体的意义巨大，若功能失衡，容易引发众多疾病，了解TFEB在能量代谢中的作用对于许多疾病的治疗和预防也有重大意义。这些发现，不仅拓展了TFEB作为一个调控因子所具有的新的功能，也揭示，运动训练中骨骼肌细胞的维护受同一因子调控，综合了能量代谢转换和损伤修复的协同过程。

由于对TFEB的认识起步较晚，目前对于TFEB在生命体中的众多功能并没有完全掌握，如TFEB在自噬通路中，与众多自噬相关因子之间的关系以及和能量代谢之间的关系等。