有氧运动通过增强PI3K/Akt信号通路活性抑制阿尔茨海默症小鼠大脑皮质和海马组织老年斑的形成

房国梁，赵杰修，张 漓，李 良，李鹏飞，李 茜

阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，AD）是以进行性认知功能障碍和记忆力衰退为主要特征的神经系统退行性疾病，多发于老年人（Blennow et al.，2006）。AD会导致情感和性格变化，行为异常，严重影响日常生活能力。而脑内老年斑的出现（Cappai et al.，2008）是该病最为典型的病理学特征之一。

研究表明，β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）是老年斑的主要成分，是AD致病和发病的关键性因素。Aβ由β-淀粉样前体蛋白（amyloid β-protein precursor，APP）降解形成，APP可经α-、β-和γ-三种分泌酶的剪切分别降解为不同的片段。正常情况下，APP由α-分泌酶降解成可溶性的sAPPα和C83片段，C83再进一步由γ-分泌酶降解产生可溶性的P3和APP胞内结构域（AICD）（Willnow et al.，2013）。而在病理情况下，APP经β-分泌酶降解成可溶的sAPPβ和贯穿膜成分的C99片段，C99进一步由γ-分泌酶降解为AICD和难溶的Aβ。β-分泌酶1（β-site APP cleaving enzyme 1，BACE1）是β-分泌酶的主要成分（Haass et al.，1992）。Aβ有两种形式Aβ40和Aβ42，因Aβ42主要积聚在神经细胞内，因此具有较强的细胞毒性（Yan et al.，2006）。磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）信号通路在AD发生发展过程中具有重要调控作用。有研究报道PI3K/Akt信号通路的活化能够减少β-分泌酶和γ-分泌酶的含量，从而减少Aβ的形成（He et al.，2016）。

已有研究表明，长期有规律地体育运动能够有效延缓AD的发生（徐波 等，2018；赵娜 等，2018；张瑞萍 等2017），但其作用机制尚未完全明确。我们前期的研究已发现有氧运动能够提高小鼠和大鼠大脑皮质及海马组织PI3K/Akt通路活性（Fang et al.，2018；Fang et al.，2017；房国梁 等，2017），并降低APP/PS1 小鼠大脑皮质和海马组织Aβ蛋白水平（房国梁 等，2017）。但是有氧运动是否通过PI3K/Akt信号通路调控老年斑的形成，目前国内外鲜见报道。因此，本研究利用PI3K/Akt特异性抑制剂GNE-317抑制PI3K/Akt信号通路活性，观察8周有氧运动后APP/PS1 转基因小鼠大脑皮质和海马组织中老年斑及各蛋白因子的变化情况，以揭示有氧运动减少老年斑形成的作用机制，为阐明有氧运动延缓AD发生提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物饲养及分组

40 只8 月 龄 雄 性APP/PS1 转 基 因 小 鼠，体 重 为30.15±3.43 g。每笼2 只小鼠，自由进食饮水，光照比为12 h：12 h，温度（20±2）℃，相对湿度40%～60%。适应性饲养1周后，随机分为4组，安静组（SE，n=10）、运动组（EX，n=10）、GNE-317处理安静组（SEG，n=10）和GNE-317处理运动组（EXG，n=10）。

1.2 训练方案

所有小鼠先进行5 天的跑台适应性训练，每天训练10 min，速度9 m/min。休息2天后， EX和EXG组小鼠进行为期8周的正式训练。在8周时间内跑台速度从12 m/min增至15 m/min，训练时间从30 min增至60 min，跑台坡度为0o。每周一至周五训练，周六、日休息。SE和SEG组小鼠则一直处于安静状态。

1.3 给药方案

适应性训练结束以后，SEG和EXG组小鼠给予GNE-317（美国MEC公司）处理。GNE-317是一种特异的PI3K/Akt信号通路抑制剂，可以穿透血脑屏障，显著抑制小鼠脑中Akt的磷酸化，具有高效、长久、低毒的抑制活性（Salphati et al.，2012，2014；付鹏宇 等，2018；田振军 等，2018；张琳 等，2017）。按照每只小鼠30 mg/kg/天的剂量通过灌喂方式给药8周（Salphati et al.，2012，2014）。

1.4 Morris水迷宫测试

在第9周采用Morris水迷宫检测各组小鼠定位航行和空间探索行为，判断各组小鼠学习记忆和空间记忆的认知能力。前5天，每日将小鼠头朝池壁固定从同一象限入水，记录其自入水后至找到平台所需时间。每只小鼠每日进行4次测试，每次测试间隔至少15 min，4次测试的平均值作为当天最终成绩。第6天撤除平台，将小鼠面向池壁从同一象限放入水中，记录自入水后至找到原平台所在位置所需时间和距离，即为逃逸时间和逃逸距离。

1.5 样品制备

Morris水迷宫实验结束后，所有小鼠用10%水合氯醛溶液腹腔麻醉，断头取脑，在冰上迅速分离相同部位大脑皮质和两侧海马组织，放入液氮冷冻。然后将样品转入-80℃冰箱中保存待测。

1.6 免疫组化实验

小鼠大脑皮质或海马组织石蜡切片脱蜡水化，然后加入3% H2O2室温孵育10 min。蒸馏水冲洗后用PBS清洗5 min×2，随后用10%正常山羊血清封闭，室温孵育10 min。弃血清，按照1：100浓度滴加兔抗Aβ42抗体（Abcam公司）工作液，4℃孵育过夜，然后用PBS清洗5 min×3。滴加生物素标记的山羊抗兔二抗（Beyotime公司）工作液，37℃孵育30 min。PBS清洗5 min×3。滴加适量SABC，37℃孵育30 min。PBS清洗5 min×3。在切片上滴加DAB显色液，室温孵育10 min，蒸馏水充分冲洗，随后复染，脱水，透明，封片，镜检。随机选择10个视野计算阳性细胞数量平均值。

1.7 Western blot实验

将小鼠大脑皮质和海马组织在液氮中研磨后，迅速加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液进行细胞组织的充分裂解。4℃，12 000 ×g离心15 min，取200 μL上清液加入50 μL 5×蛋白上样缓冲液，放入100℃水浴锅中进行蛋白变性，持续10 min。然后进行SDS-PAGE电泳，电泳后将蛋白转至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭膜1 h，然后将膜与稀释好的一抗4 ℃孵育过夜（PI3K p110、PI3K p85抗体购自Cell Signaling Technology公司；APP、Aβ42和BACE1 抗体购自Abcam 公司；Akt、Phospho-Akt Thr308、Phospho-Akt Ser473和β-actin抗体购自Beyotime公司）。次日用TBST洗膜5 min×3，洗去残留一抗，然后将膜与稀释好的二抗室温孵育1 h（HRP标记山羊抗兔 IgG和HRP标记山羊抗小鼠 IgG购自Beyotime公司），然后用TBST洗膜5 min×4，以洗去残留的二抗。最后使用ECL化学发光试剂和X光片检测蛋白信号。

1.8 数据统计

使用Image J软件进行Western blot条带的灰度分析，应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，文中所有统计数据为3次独立实验结果的平均值±S.D.，显著性检验选择双尾t检验，与SE相比，*代表P＜0.05，有显著性差异，**代表P＜0.01，有极显著性差异；与SE相比，&代表P＜0.05，有显著性差异，&&代表P＜0.01，有极显著性差异；与SEG相比，#代表P＜0.05，有显著性差异，##代表P＜0.01，有极显著性差异；与EX相比，△代表P＜0.05，有显著性差异，△△代表P＜0.01，有极显著性差异。

2 结果

前期研究已证实，8 周有氧运动能够显著提高APP/PS1小鼠大脑皮质和海马组织中PI3K p110和p85亚基的蛋白含量，并且提高Akt Thr308和Ser473位点的磷酸化水平。而GNE-317能有效抑制APP/PS1小鼠大脑皮质和海马组织中Akt Thr308和Ser473位点的磷酸化（FANG et al.，2018）。说明有氧运动能够提高小鼠大脑皮质和海马组织PI3K/Akt信号通路活性，而GNE-317通过抑制Akt的磷酸化从而降低PI3K/Akt信号通路活性。

2.1 PI3K/Akt信号通路在有氧运动减少老年斑形成中发挥调控作用

为验证PI3K/Akt信号通路在有氧运动减少老年斑形成中是否发挥作用，利用Aβ42抗体进行免疫组化实验，并计算各组小鼠大脑皮质和海马组织中老年斑的数量。

从图1 可以发现，SE、EX、SEG和EXG组小鼠大脑皮质中老年斑的数量分别为125±12个/mm2、81±9个/mm2、189±20 个/mm2和124±10 个/mm2（图1B）；海 马 组 织中 老 年 斑 的 数 量 分 别 为104±8 个/mm2、67±7 个/mm2、153±12个/mm2和91±10个/mm2（图1D）。从上述结果可以看出，经过8周有氧运动后EX组小鼠大脑皮质和海马组织中老年斑的数量与SE组相比显著减少，说明有氧运动能够减少老年斑的形成。而GNE-317处理8周后，SEG组和EXG组小鼠大脑皮质和海马组织中老年斑的数量分别与SE和EX组相比显著上升（图1B、D）。上述结果说明，抑制PI3K/Akt信号通路能够有效降低有氧运动对减少老年斑形成的积极作用。

2.2 PI3K/Akt信号通路在有氧运动减少老年斑中的作用机制

Aβ是老年斑的主要成分，而APP是Aβ的前体蛋白，α-、β-、γ-分泌酶则在APP形成Aβ过程中具有不同的剪切功能。因此通过比较分析各组小鼠大脑皮层和海马组织APP、Aβ42以及BACE1的含量变化，探讨PI3K/Akt信号通路在有氧运动减少脑内Aβ积聚中的作用机制。

SE、EX、SEG和EXG组小鼠大脑皮质中APP蛋白含量无显著差异（图2A、B）。而EX组Aβ42和BACE1 的含量与SE组相比显著下降，分别为SE组水平的53.1%（P＜0.01，图2C）和45.6%（P＜0.05，图2D）。而在GNE-317处理8周后，SEG组和EXG组大脑皮质中Aβ42和BACE1的含量分别与SE组和EX组相比显著提高；其中SEG组Aβ42和BACE1的含量分别约为SE组水平的1.62倍和1.65倍（P＜0.01，图2C、D）；EXG组Aβ42和BACE1的含量分别约为EX组水平的1.84倍和1.82倍（P＜0.01，图2C、D）。

SE、EX、SEG和EXG组小鼠海马组织中APP蛋白含量同样也没有显著差异（图3A、B）。而EX组Aβ42和BACE1的含量与SE组相比显著下降，分别为SE组水平的45.2%（P＜0.01，图3C）和41.3%（P＜0.05，图3D）。GNE-317处理8周后，SEG组和EXG组海马组织中Aβ42和BACE1的含量分别与SE组和EX组相比显著提高；其中SEG组Aβ42和BACE1 的含量分别约为SE组水平的1.54 倍和1.85 倍（P＜0.01，图3C、D）；EXG组Aβ42和BACE1的含量分别约为EX组水平的2倍和2.24倍（P＜0.01，图3C、D）。

图1 各组小鼠大脑皮质和海马组织Aβ42免疫组化结果Figure 1. Immunohistochemical Results of Aβ42 in the Cerebral Cortex and Hippocampus of Mice in Each Group

图2 8周有氧运动和GNE-317对APP/PS1小鼠大脑皮质老年斑形成的影响Figure 2. The Effects of 8-week Aerobic Exercise and GNE-317 on the Formation of Senile Plaques in Cerebral Cortex of APP/PS1 Mice

图3 8周有氧运动和GNE-317对APP/PS1小鼠海马组织老年斑形成的影响Figure 3. The Effects of 8-week Aerobic Exercise and GNE-317 on the Formation of Senile Plaques in Hippocampus of APP/PS1 Mice

上述结果说明，有氧运动能够降低APP/PS1 小鼠大脑皮质和海马组织中β-分泌酶的含量，使APP蛋白有更多机会通过α-分泌酶降解为可溶的小分子蛋白，从而降低Aβ42的含量；而GNE-317 抑制PI3K/Akt信号通路后脑内β-分泌酶的水平上升，从而导致Aβ42的含量提高。

2.3 PI3K/Akt信号通路对有氧运动提高学习记忆和空间记忆的影响

通过Morris水迷宫实验比较分析各组小鼠的行为学差异，以判断PI3K/Akt信号通路对有氧运动提高学习记忆和空间记忆的影响。

实验结果显示，SE、EX、SEG和EXG组小鼠的逃逸 时 间 分 别 为48.9±6.5 s、37.1±4.3 s、59.0±6.0 s 和48.8±6.4 s（图4A）；逃逸距离分别为839.8±106.5 cm、683.5±110.8 cm、1014.6±148.8 cm 和876.8±91.9 cm（图4B）。从结果中可以看出，EX组逃逸时间和逃逸距离均显著低于SE组。而经GNE-317 处理8 周后，SEG和EXG组其逃逸时间和逃逸距离分别与SE和EX组相比均显著增加。上述结果说明，有氧运动能够显著提高APP/PS1 小鼠的学习记忆和空间记忆力，而抑制PI3K/Akt信号通路能够降低有氧运动提高小鼠学习记忆和空间记忆力的效果。

图4 各组小鼠Morris水迷宫测试结果Figure 4. Results of Morris Water Maze Test

3 讨论

脑内老年斑的大量出现是AD最为典型的病理学特征之一，被认为是AD的主要致病因素。而老年斑的主要成分是Aβ。已有研究发现，体育运动能够影响α-、β-、γ-分泌酶的活性，降低AD模型动物脑内Aβ的水平。Adlard等（2005）发现，1月龄TgCRND8转基因小鼠在进行5个月自主跑轮运动后，脑内Aβ40和Aβ42蛋白含量均降低。Liu等（2013）发现，3月龄APP/PS1转基因小鼠进行为期5个月的跑台运动，可显著减少脑内Aβ的积聚。在Mirochnic等（2009）的实验中，经过运动训练的APP23小鼠其APP mRNA含量比未经过训练的小鼠减少了46%。实验还发现运动后小鼠脑内γ-分泌酶的活性有所改变，同时运动还可降低转基因小鼠β-分泌酶的蛋白水平（Kang et al.，2013），并通过激活Sirtl蛋白表达从而促进α-分泌酶活性（Donmez et al.，2010）等。有研究证据表明，α-、β-、γ-分泌酶的含量可能受PI3K/Akt信号通路调控。He等（2016）研究发现，硫化氢通过激活大脑皮质中PI3K/Akt信号通路降低β-分泌酶和γ-分泌酶的含量。柴水琴等（2015）研究发现，注射罗格列酮后ob/ob小鼠海马组织中Akt被激活，进而降低海马组织中β-分泌酶的含量。那么有氧运动减少老年斑的形成、降低脑内Aβ的水平是否是通过激活PI3K/Akt信号通路实现的呢？

为了验证此假设，我们选择了广泛使用的AD模型小鼠APP/PS1转基因小鼠，这种小鼠可表达突变的人类早老素（DeltaE9）和人鼠淀粉样前蛋白（APPswe）融合体，导致早发性老年痴呆症，6-7 月龄APP/PS1小鼠脑内即可检测到Aβ的形成（Lok et al.，2013）。同时我们利用PI3K/Akt信号通路特异性抑制剂GNE-317，通过灌喂的方式处理8周，抑制小鼠脑中PI3K/Akt通路活性。GNE-317 可以穿透血脑屏障，有效抑制Akt Thr308位点和Ser473位点的磷酸化水平（Salphati et al.，2012，2014）。由于我们在前期的研究中已证实，8周有氧运动能够提高小鼠大脑皮质和海马组织PI3K/Akt信号通路活性，而GNE-317则能有效抑制APP/PS1小鼠大脑皮质和海马组织中Akt Thr308和Ser473位点的磷酸化（Fang et al.，2018），从而降低PI3K/Akt信号通路活性。因此在本研究中更多地关注对老年斑形成的影响。

免疫组化实验显示，8周有氧运动后EX组小鼠大脑皮质和海马组织老年斑的数量与SE组相比显著减少。通过Western blot实验进一步发现，其Aβ42和BACE1的含量也显著降低，而APP蛋白含量并没有发生显著改变。经GNE-317处理8周后，SEG组和EXG组小鼠大脑皮质和海马组织中老年斑的数量分别与SE和EX组相比显著上升，另外其Aβ42和BACE1的含量也显著上升。由于GNE-317是PI3K/Akt信号通路特异性抑制剂，因此上述结果说明，抑制小鼠大脑皮质和海马组织PI3K/Akt信号通路活性，提高了β-分泌酶的含量，使APP蛋白更多通过β-分泌酶降解为难溶的Aβ，导致老年斑数量增多。而有氧运动增强了大脑皮质和海马组织中PI3K/Akt信号通路活性，减少了β-分泌酶的含量，使APP蛋白有更多机会通过α-分泌酶降解为可溶的小分子蛋白，从而降低Aβ的含量，减少老年斑的形成。另外有氧运动能够提高小鼠的学习记忆和空间记忆能力。当然本项研究还有很多不足之处，PI3K/Akt信号通路调控β-分泌酶含量的机制有待进一步研究。

4 小结

有氧运动通过增强APP/PS1小鼠大脑皮质和海马组织中PI3K/Akt信号通路活性，降低β-分泌酶的含量，使APP蛋白有更多机会通过α-分泌酶降解为可溶的小分子蛋白，导致Aβ蛋白含量降低，有效减少老年斑的形成，提高认知功能。因此，有氧运动对于防治阿尔茨海默症具有积极作用。