绿豆药材质量控制方法研究

安巧　石锦霞　周美　蒋坤　李星　夏文　吴贵辉

摘要    為了建立绿豆药材的地方标准，采用经验、显微鉴别法对该药材性状、显微特征进行描述;按照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则相关方法，对绿豆中水分、灰分和酸不溶性灰分进行了测定;采用薄层色谱法，以牡荆苷为对照，对药材进行定性鉴别;采用HPLC法，以牡荆苷为对照，采用Agilent ZOR-BAX SB-C18（5 μm，4.6 mm×250.0 mm）色谱柱，甲醇-水（40∶60）为流动相，检测波长340 nm下进行定量分析，建立绿豆中牡荆苷的含量测定方法。结果表明，该药材性状、显微鉴别、薄层鉴别方法具有较强的专属性，水分为9.91%～12.57%，总灰分为2.51%～3.22%，酸不溶性灰分为0.03%～0.11%，牡荆苷含量为0.127%～0.248%。上述结果表明，建立的标准具有很好的专属性和准确性，可以作为绿豆药材的地方质量标准。

关键词    绿豆;质量标准;牡荆苷;薄层色谱法;高效液相色谱法

中图分类号    R284.1        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2019）19-0047-03                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Research  on  Quality  Standards  of  Mung  Bean

AN Qiao 1，2    SHI Jin-xia 3    ZHOU Mei 2    JIANG Kun 1    LI Xing 1    XIA Wen 1    WU Gui-hui 1 *

（1 Guizhou Bailing Enterprise Group Pharmaceutical Co. Ltd.，Anshun Guizhou 561000; 2 The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences; 3 Guizhou University of Traditional Chinese Medicine）

Abstract    In order to establish the local quality standards of mung bean，the morphological characters and microscopic characteristics of mung bean were described by means of empirical and microscopic identification. The contents of water，total ash and acid-insoluble ash were analyzed according to the methods of Chinese Pharmacopoeia（2015）.Vitexin was used to identify materia medica of mung bean by TLC. HPLC method was used to establish a quantitative method for the determination of vitexin contents in mung bean by using Agilent ZOR-BAX SB-C18（5 mm，4.6 mm×250.0 mm）chromatographic column and methanol-water（40∶60）as mobile phase with detection wavelength of 340 nm.The results showed that the morphological characters，microscopic features and TLC methods were proper，the congtents of water were 9.91%-12.57%，total ash were 2.51%-3.22%，acid-insoluble ash were 0.03%-0.11%，vitexin were 0.127%-0.248%. All of the above data proved that the established quality of coutrol method is specific and accurate，which is suitable for the quality evaluation of mung bean.

Key words    mung bean;quality standard;vitexin;TLC;HPLC

绿豆，为豆科植物绿豆（Phaseolus radiatus L.）的干燥成熟种子，在中国各地均有种植，是常用的药食两用植物，具有降脂、抗肿瘤、减轻化疗药物毒性、解毒等功效[1]。现代药理学研究表明，绿豆具有抗氧化[2-3]、抑菌[4-6]、抗肿瘤[7-9]、降血脂[10]、解毒[11]、预防骨质疏松症[12]等药理作用。绿豆是《中国药典》2015年版中收藏的多个成方制剂如护肝片、护肝丸、护肝颗粒、护肝胶囊、消络痛片、消络痛胶囊和清宁丸等的重要组成药味。目前，绿豆的质量标准有《绿豆》（GB/T 10462—2008）（按粮油标准起草）;各省地标收载的目录有《湖南省中药材标准》（2009年版）、《甘肃省中药材标准》（2008年版）、《山东省中药材标准》（2002年版）、《黑龙江省中药材标准》（2001年版）、《广东省中药材标准》（2011年版）等。以上标准中并未对其药效成分进行定性、定量分析检测，目前有文献[13-16]报道了绿豆中牡荆苷和异牡荆苷的含量测定方法，但有的色谱峰分离不理想，有的流动相中添加酸，有的用乙腈做流动相。本研究用甲醇-水做流动相，色谱峰分离较好，且甲醇价廉易得，检测经济成本低。本研究增加了绿豆质量控制项，进一步提升本品入药安全可控性。本文的质量控制方法可以作为绿豆的地方质量标准，更有利于制药企业使用并鉴定药材。

1    材料与方法

1.1    仪器与材料

显微镜（舜宇光学科技（集团）有限公司，XD20-RFL），Smar V350图像采集系统;CAMAG TLC VISUALIZER;KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;十万分之一电子分析天平（Mettler Toledo Excellence Plus）;800离心机（江苏省金壇市荣华仪器制造有限公司）;Agilent1200高效液相色谱仪。

牡荆苷对照样品（批号111687-200602，中国食品药品检定研究院），甲醇为色谱纯，娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯;GF254薄层板（青岛海洋化工有限公司）;10批绿豆药材，均为市售。

1.2    性状观察

观察绿豆样品的性状特征。

1.3    显微特征鉴别

原药材粉碎，过5号筛，取适量粉末，加水和氯醛液2～3滴，用细玻璃棒搅匀，并在酒精灯上加热至透化，再滴加稀甘油1滴混匀，加盖玻片即可。然后进行显微观察。

1.4    薄层鉴别

1.4.1    溶液制备。精密称取牡荆苷对照样品1.07 mg，加70%甲醇制成浓度为0.535 mg/mL的溶液，作为对照样品溶液。取绿豆粉末（过2号筛）2 g，精密称定，精密加入70%甲醇20 mL，超声处理1 h，放冷，离心10 min（4 000 r/min），放冷;取10 mL于蒸发皿中蒸干，残渣加70%甲醇2 mL使其溶解，离心10 min（4 000 r/min），过滤（微孔滤膜），取续滤液作为供试液。

1.4.2    样品鉴别。照薄层色谱法（《中国药典》（2015年版）第四部通则0502）试验，分别吸取牡荆苷对照样品溶液和上述供试样品溶液各1 μL，点于同一GF254薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100∶17∶13）为展开剂，饱和20 min，展开，取出，自然晾干。

1.5    水分、总灰分及酸不溶性灰分检测

按照中药及其杂质检测与一般质量控制方法，進行水分、总灰分和酸不溶性成分检测。

1.5.1    水分。取各产地绿豆粉末约3 g（过2号筛），精密称定，按照《中国药典》（2015年版）通则0832水分测定法第一法进行测定。每批平行测定2份。

1.5.2    总灰分。取各产地绿豆粉末约5 g（过2号筛），精密称定，按照《中国药典》（2015年版）四部通则2302灰分测定法进行测定。每批平行测定2份。

1.5.3    酸不溶性灰分。取灰分测定项所得的灰分，根据《中国药典》（2015年版）四部通则2302进行测定，每批平行测定2份，计算供试样品中酸不溶性灰分的含量（%）。

1.6    HPLC法测定牡荆苷含量

1.6.1    方法确定。①检测波长的选择。采用Agilent1200型高效液相色谱仪，DAD二极管阵列检测器全波长扫描。②流动相的选择。分别选择乙腈∶水（23∶77）和甲醇∶水（40∶60）作为流动相，比较峰形和分离度。③提取条件的考察。取绿豆细粉（过3号筛）0.5 g，精密称定，置于150 mL具塞锥形瓶中，分别精密加入相应的溶剂25 mL，精密称定重量，选择回流或超声提取90 min，静置，放冷，再称定质量，用相应的溶剂补足减失的重量，摇匀，取上清液离心（2 000 r/min，20 min），过滤，取续滤液作为供试样品溶液;以牡荆苷作为考察指标，考察回流和超声提取方法的效果（平行做2份）。

1.6.2    含量测定。①色谱条件。采用Agilent ZOR-BAX SB-C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）色谱柱;以甲醇-水（40∶60）为流动相;流速为1.0 mL/min;柱温为30 ℃;进样量为20 μL;检测波长为340 nm。②溶液制备。取牡荆苷对照样品5 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照样品储备液;然后精密量取5 mL稀释至10 mL，作为对照样品溶液。取绿豆细粉（过3号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，称定重量，加热回流90 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，取上清液离心（2 000 r/min，20 min），过滤，取续滤液作为供试样品溶液。③含量测定。取供试样品溶液，依法测定，每批平行2份，计算牡荆苷的含量。

1.6.3    方法检验。一是系统适应性试验。精密吸取对照样品溶液、供试样品溶液及空白溶剂各20 μL，注入高效液相色谱仪。二是线性关系考察。精密称取牡荆苷对照样品适量，用70%甲醇制成浓度为0.102 4 mg/mL的对照样品储备液，作为1号对照样品溶液，精密量取1号对照品储备液5 mL置于10 mL容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，摇匀，作为2号对照样品溶液。依次采取对半稀释的方法得到3～5号对照样品溶液。分别取1～5号对照样品溶液（浓度依次为0.102 4、0.051 2、0.026 0、0.012 8、0.006 4 mg/mL）各进样20 μL，记录峰面积。以峰面积Y为纵坐标，对照样品浓度X为横坐标，进行线性回归分析。三是仪器精密度试验。取1.6.2中对照样品溶液，重复进样5次，检测仪器的精密度。四是方法精密度试验。取绿豆细粉（过50目筛）约0.5 g，精密称定，按1.6.2方法制备供试样品溶液，连续进样6次，检测方法精密度。五是重复性试验。取同一批药材6份，按1.6.2方法制备供试样品溶液，进样分析。六是稳定性试验。取同一供试样品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，测定峰面积。七是加样回收率试验。精密称取已知含量的同一批药材6份，各0.25 g，精密称定，对照样品的加入量按照1∶1加入，按1.6.2方法制备供试样品溶液，依法测定。八是耐用性试验。取各产地绿豆细粉各0.5 g，每批平行2份，精密称定，按1.6.2方法制备供试样品溶液，分別考察本方法在流动相比例、柱温、流速的小范围波动及不同厂家色谱柱下的测定结果。九是中间精密度试验。在同一实验室，在不同日期由不同分析人员在不同仪器上进行测定，按1.6.2方法制备供试样品溶液，依法测定。

2    结果与分析

2.1    性状

供试绿豆样品呈类圆柱形或类球形，长4～6 mm、直径3～4 mm，表面黄绿色、黄褐色或墨绿色，具光泽;种脐位于一侧，呈白色纵向线形，长约为种子的1/3;种皮薄而韧，剥离后露出淡黄绿色或黄绿色的种仁;子叶2枚，肥厚;质坚硬，难破碎;气微，味淡，嚼之有豆腥味。

2.2    显微特征

供试绿豆样品粉末呈灰白色或浅黄白色。淀粉粒甚多，多为单粒，肾形、长椭圆形、类圆形、类三角形或不规则形。种皮栅状细胞表面观类多角形，壁较厚，胞腔细小或不明显;侧面观细胞1列呈栅栏状，狭长，胞腔条状。种皮支持细胞1列，表面观呈长圆形。星状细胞呈不规则多角形，由多数短分支状突起，胞腔内含黄棕色物。色素块较多，黄棕色或绿黄棕色，存在于星状细胞或薄壁细胞中（图1）。

2.3    薄层鉴别

供试样品色谱图中，在与对照样品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点（图2）。说明上述条件能够较好地将各斑点分离，显色清晰。

2.4    水分、总灰分及酸不溶性灰分检测

水分、总灰分及酸不溶性灰分检测结果见表1。

2.5    HPLC法测定牡荆苷含量

2.5.1    方法确定。试验结果表明，牡荆苷在340 nm有最大吸收;选择乙腈∶水（23∶77）作为流动相峰形差、分离度差，而选择甲醇∶水（40∶60）作为流动相峰形良好、分离度好;50%、70%甲醇回流提取时，牡荆苷含量较高，但50%甲醇提取沉淀物较多（表2）。因此，选择340 nm作为检测波长、甲醇∶水（40∶60）作为流动相、70%甲醇回流90 min作为提取方法。

2.5.2    含量检测及方法检验。10份绿豆样品中牡荆苷含量见表1。系统适应性试验结果显示，牡荆苷与其他色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数按牡荆苷峰计不低于3 000，空白溶剂无干扰。对绿豆中牡荆苷含量进行线性回归分析，回归方程为Y=32 238.213 5X-8.528 532 2（r=1.000），在0.006 4～0.102 4 mg/mL范围内牡荆苷含量的线性关系良好。仪器精密度试验结果表明，牡荆苷峰面积RSD为0.36%，表明仪器精密度良好。方法精密度试验结果表明，牡荆苷峰面积的RSD为0.29%，表明方法精密度良好。重复性试验中，牡荆苷的平均含量为0.145%，RSD为1.17%，表明重复性良好，符合分析方法的要求。稳定性试验结果显示，供试样品中牡荆苷含量的RSD为1.18%，表明供试样品溶液在24 h内稳定。加样回收率试验中，牡荆苷的平均回收率为102.2%，RSD为1.17%，表明回收率良好，符合分析方法的要求。耐用性试验分别考察本方法在流动相比例、柱温、流速的小范围波动及不同厂家色谱柱下的测定，结果表明，该方法耐用性较好（表3）。中间精密度试验结果表明，该方法中间精密度良好（表3）。

3    结论与讨论

为了建立绿豆药材的地方标准，采用经验、显微鉴别法对该药材性状、显微特征进行描述;按照《中华人民共和国药典》（2015年版）四部通则相关方法，对绿豆中水分、灰分和酸不溶性灰分进行了测定;采用薄层色谱法，以牡荆苷为对照，对药材进行定性鉴别;采用HPLC法，以牡荆苷为对照，采用Agilent ZOR-BAX SB-C18 5 μm，4.6 mm×250.0 mm色谱柱，甲醇-水（40∶60）为流动相，检测波长340 nm下进行定量分析，建立绿豆中牡荆苷的含量测定方法。结果表明，该药材性状、显微鉴别、薄层鉴别方法具有较强的专属性，水分为9.91%～12.57%，总灰分为2.51%～3.22%，酸不溶性灰分为0.03%～0.11%，牡荆苷含量为0.127%～0.248%。

本研究建立了测定牡荆苷含量的HPLC法，该方法系统适应性、仪器精密度、方法精密度、重复性、回收率、耐用性、中间精密度均较好，在0.006 4～0.102 4 mg/mL范围内线性关系良好，供试样品溶液在24 h内稳定，符合分析方法的要求;且本方法用甲醇-水作流动相，色谱峰分离较好、甲醇价廉易得，检测经济成本低。本研究收集了10个产地的绿豆药材，具有一定的代表性，建议绿豆的水分≤15.0%，总灰分≤4.0%，酸不溶性灰分≤0.13%;以干燥样品计算，牡荆苷含量≥0.10%。本研究增加了绿豆质量控制项，进一步提升绿豆入药安全可控性。本文的质量控制方法可以作为绿豆的地方质量标准，更有利于制药企业使用并鉴定药材。

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