雷公藤甲素通过PD-1／PD-L1信号通路缓解肾移植急性排斥反应的作用

陈学勋，孙己晶，刘叶伟，孙秀菊，李香玲，张海波，郭 民∗

（1.潍坊医学院附属医院，山东 潍坊261041；2.潍坊医学院，山东 潍坊261000；3.潍坊市峡山经济生态开发区人民医院，山东 潍坊261000）

慢性肾脏病已成为全球健康问题，肾移植是终末期肾脏病的最佳治疗方法［1］。肾移植面临的最主要难题排斥反应，研究证实，急性排斥反应主要是T 细胞介导的免疫应答，效应性活化T 细胞CD3＋、CD4＋等的增殖，调节性T 细胞的衰减所造成移植器官的损害［2］。雷公藤甲素（triptolide TPT）是从雷公藤中提取的抑制T 细胞增殖最强的有效成分，器官移植术中临床和实验都证明了雷公藤甲素能够通过抑制T 细胞增殖，上调调节性T 细胞而有效地延长移植物存活时间并且能够预防移植物抗宿主病的发生［3-4］，具体机制可能通过多条信号通路途径实现抗排斥反应。程序性死亡配体（programmed death ligand 1，PD-L1）是属于B7家族的一种抑制性共刺激分子，与程序性死亡受体1（programmed death 1，PD-1）结合后，抑制活化T 细胞增殖，PD-1和PD-L1通过多途径提供调节中枢和外周耐受的抑制信号，其中调节性T 细胞可能是其重要的靶点，从而对移植器官有保护作用［5-6］。本研究旨在阐明PD-1／PD-L1信号通路在雷公藤甲素缓解肾移植急性排斥反应中的作用及机制。

1 材料

1.1 动物 健康雄性Wistar 大鼠3个月龄，体质量（200±15）g，来源于潍坊医学院动物实验室，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号SCXK（鲁）20140007。实验动物中心饲养大鼠恒定的温度（21±1）℃和湿度50%～70%。日／夜周期计算维持在12 h。所有程序均经潍坊医学院附属医院动物伦理委员会批准通过。

1.2 试药 雷公藤甲素（批号QZ000326，含有量≥98%）购于南京青泽医药技术发展有限公司；anti-mouse PD-L1（批号AM85436）购于美国BioXcell 公司；血清肌酐试剂盒（批号180681）购于瑞士Roche 公司；ECL 试剂（批号A4306）购于德国Amersham Biosciences 公司；兔抗人PDL1一抗（批号160509201764）、HRP 标记的IgG 二抗（批号1923102018132）购于美国CST 公司；RNA 提取试剂盒（批号4381662）、逆转录试剂盒（批号1600533）购于美国R＆D Systems 公司。

1.3 仪器 手术器械均购自上海医疗器械公司；手术显微镜购于镇江光学仪器有限公司；流式细胞仪购于美国BD 公司；全自动生化分析仪购于美国Beckman Instruments 公司；聚氟乙烯薄膜（P4502）购于美国Pall Life Sciences 公司。

2 方法

2.1 肾移植模型 选择健康雄性Wistar 大鼠8只作为空白对照，健康雄性SD 大鼠32只作为供体，另取32只健康雄性Wistar 大鼠作为受体。供体大鼠建模前12 h 禁食，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，固定手术桌上，经中线切口显露左肾，结扎肾上腺动静脉分支，切断肾动脉，4 ℃灌流含肝素生理盐水经腹主动脉至肾动脉，然后分离输尿管，将左肾静脉连接导管后取出肾脏保存于4 ℃含肝素生理盐水中。受体大鼠同样步骤麻醉固定。受体肾暴露后移除，供肾通过导管连接，开放动脉静脉后移植肾供血发红，尿液从输尿管流出2～3 min。大鼠术后不限饮食，均接受青霉素（104 IU／kg）肌肉注射7 d。

2.2 雷公藤甲素（triptolide，TPT）溶剂配制 雷公藤甲素20 mg／支，加入二甲基亚砜1 mL，50 ℃超声震荡30 min，加注射用水配成含雷公藤甲素0.1 mg／mL 的溶液，除菌过滤分装，4 ℃冷藏保存备用。

2.3 分组 空白对照组8例不做任何处理；急性排斥（acute renal allograft rejection，AR）组，腹腔注射生理盐水；雷公藤甲素组，腹腔注射雷公藤甲素0.25 mg／kg；anti-PDL1组，腹腔注射抗鼠程序性死亡配体1抗体（anti-mouse PD-L1）3 mg／d；雷公藤甲素＋anti-PD-L1组，同时腹腔注射雷公藤甲素0.25 mg／kg、anti-mouse PD-L1 3 mg／kg。从移植后当日开始腹腔注射给药，1次／d，直到大鼠临近死亡处死，每组8只。

2.4 生长状态和肾功能评价 记录存活时间（d）、体质量（g）和生理状态，检测血清肌酐水平。

2.5 肾组织形态学观察 肾移植后5 d 各组处死3只获得肾组织，其余肾组织待大鼠萎靡不振，呼吸微弱，临近死亡状态时处死获取，甲醛固定，石蜡包埋，切片，脱蜡，脱水，进行HE 和PAS 染色。按Banff 标准评价排斥反应程度，根据炎症因子浸入程度，肾间质损害程度分为6级，正常、交界性改变、Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲa 级、Ⅲb 级。

2.6 mRNA 表达检测 采用实时荧光定量PCR 方法检测。根据制造商的说明，用TRIZOL 提取和反转录成cDNA，提取总RNA。引物设计Primer 6.0和合成由Invitrogen 公司（表1）。进行反应，在55 ℃1 min，其次是35个周期的92 ℃30 s，58 ℃45 s，72 ℃为35 s。GAPDH 作为内参照。按2-△△CT方法计算结果。

表1 引物序列

2.7 蛋白表达检测 采用Western blot 法。液氮研磨后与RIPA 处理15～30 min，超声波处理4次，5 s／次，4 ℃10 000g／min 离心5 min，取上清液。总蛋白进行10% SDSPAGE 电泳分离和转移到PVDF 膜，5%脱脂奶2 h 封闭后，膜在PD-L1单克隆抗体（稀释1 ∶1 000）孵育，4 °C 过夜。清洗后的膜PBST，进一步加入二抗（稀释1 ∶2 000）30 min，膜处理的ECL 为1 min，并在X 射线下曝光。Quantity One 软件测定结合密度。所有实验均重复4次。

2.8 T 细胞亚群检测 移植后5 d 负压方法收集腹主动脉血，室温静置30 min 后，在4 ℃下3 600 r／min 离心，上清液保存于-20 ℃，肾组织保存于-80 ℃。流式试管4支，加入100 uL 抗凝后的外周血，试管一中加入5 μL 的CD3-PC5抗体，试管二管中加入5 μL 的CD4-FITC 抗体，试管三管中加入5 μL 的CD8-PE 抗体，试管四中分别加入5 μL的CD4-FITC 抗体和CD25-PE 抗体，低温静置1 h，然后添加裂解红细胞试液5 mL，然后置于离心机上，设置半径为8 cm，1 000 r／min，共计5 min，去除澄清部分，PBS 洗涤2次，使用FACS-Calibur 流式细胞仪器进行检测，使用PEMSS 4.0统计软件对测量数据进行收集与分析。

2.9 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行处理，计量资料以（）表示，多组间比较采用方差分析，多组间两两比较采用LSD 法，P＜0.05差异有统计学意义。

3 结果

3.1 生存状态、肾功能 雷公藤甲素组大鼠具有良好的状态，在肾移植的第15天开始出现排尿异常、萎靡不振和死亡；急性排斥组和雷公藤甲素＋anti-PD-L1组在第8天，Anti-PD-L1组在第5天就开始出现上述情况。与急性排斥组比较，雷公藤甲素组大鼠存活时间、体质量显著升高（P＜0.05），anti-PD-L1组以上指标显著降低（P＜0.05）；而雷公藤甲素＋anti-PD-L1组以上指标显著高于anti-PD-L1组（P＜0.05）。与急性排斥组比较，雷公藤甲素组血肌酐水平显著降低（P＜0.05），anti-PD-L1组显著升高（P＜0.05），而雷公藤甲素＋anti-PD-L1组显著低于anti-PD-L1组（P＜0.05），见表2。

3.2 肾组织形态学观察 急性排斥组典型急性排斥反应表现为弥漫的炎性细胞浸润，间质细胞水肿变性，动脉弥漫炎症，皮质出血等表现。anti-PD-L1组急性排斥反应最为严重；雷公藤甲素组病理表现较其他各组均减轻，有2例交界性病理改变；雷公藤甲素＋anti-PD-L1组急性排斥反应表现介于急性排斥组和雷公藤甲素组。见图1、表3。

表2 生存状态及肾功能情况（， n=8）

表2 生存状态及肾功能情况（， n=8）

注：与空白对照组比较，aP ＜0.05；与急性排斥组比较，bP ＜0.05；与anti-PD-L1组比较，cP ＜0.05；与雷公藤甲素＋anti-PD-L1组比较，dP＜0.05

图1 肾脏病理急性排斥分级（HE×200）

表3 肾脏病理Banff 分级（只， n=8）

3.3 在肾脏组织中PD-L1mRNA 和蛋白表达 与急性排斥组比较，雷公藤甲素组、雷公藤甲素＋anti-PD-L1组肾组织（PD-L）1 mRNA 和蛋白表达明显升高（P＜0.05），anti-PD-L1组表达降低（P＜0.05）。见图2、表4。

图2 PD-L1蛋白在肾脏组织中的表达

3.4 T 细胞亚群及调节性T 细胞比率 与急性排斥组比较，雷公藤甲素组CD3＋T、CD4＋T 细胞比率、CD4＋／CD8＋明显降低，CD8＋T、CD4＋CD25＋细胞比率明显升高（P＜0.05），anti-PD-L1组CD3＋T、CD4＋T 细胞比率、CD4＋／CD8＋明显升高，CD8＋T、CD4＋CD25＋细胞比率明显降低（P＜0.05）；而雷公藤甲素＋anti-PD-L1组则能显著逆转Anti-PD-L1组T 细胞比率（P＜0.05）。见表5。

表4 PD-L1 mRNA 和蛋白在肾脏组织中的表达（，n=8）

表4 PD-L1 mRNA 和蛋白在肾脏组织中的表达（，n=8）

注：与急性排斥组比较，bP ＜0.05；与anti-PD-L1组比较，cP＜0.05

表5 T 淋巴细胞亚群及调节性T 细胞比率（， n=8）

表5 T 淋巴细胞亚群及调节性T 细胞比率（， n=8）

注：与空白对照组比较，aP ＜0.05；与急性排斥组比较，bP ＜0.05；与anti-PD-L1组比较，cP ＜0.05；与雷公藤甲素＋anti-PD-L1组比较，dP＜0.05

4 讨论

急性排斥反应早期阶段T 淋巴细胞在肾移植排斥反应过程中占主导地位，CD3＋T 细胞、CD4＋T 细胞、CD8＋T 细胞是主要的效应细胞［2，7-9］。活化的效应性T 淋巴细胞的增殖和细胞因子产生，调节性T 细胞（Treg T）的数量和活性降低，均在移植肾急性排斥反应中起到关键性作用［10-11］。本实验急性排斥组与对照组的大鼠肾脏病理及T淋巴细胞亚群等比较，病理上表现急性排斥，Banff 分级在Ⅰ-Ⅲb 级，炎性细胞浸润，血肌酐显著升高，效应性CD3＋致［2，8-9］。表明CD3＋T 细 胞、CD4＋T细胞、CD8＋T 细 胞、CD4＋CD25＋调节性T 细胞在急性排异反应及诱导和维持免疫T 细胞、CD4＋T 细胞、CD4＋／CD8＋显著升高，CD8＋T 细胞、CD4＋CD25＋调节性T 细胞显著下降，与以往国内外研究一耐受过程中起到关键性作用。

近年来的研究表明，程序性死亡配体（PD-L1）具有负性调节T 细胞和B 细胞依赖的免疫反应介导的T 细胞的活性［5，6，12-13］。许多实验证 明PD-1／PD-L1相互作用 抑制CD4＋T 细胞、CD8＋T 细胞的增殖，诱导凋亡，同时使细胞因子下降从而减轻排斥反应［5，6，12-16］。前期实验观察到腺病毒介导的PD-L1局部转染的方式应用于肾移植及其他器官移植，均可观察到延长移植物的存活时间，减轻急性排斥反应的程度［5，12，14］。本实验发现空白对照大鼠肾脏组织内未发现PD-L1的表达，只在活化的T 细胞表达，与以往学者研究相同［5，12-15］。建立大鼠急性排斥反应，给予antimouse PD-L1阻断PD-1／PD-L1后，PD-L1表达下调，炎症状态失控，与各组比较，出现大鼠生存状态最差，肾功能最糟糕，存活时间最短，急性排斥反应病理分级最严重，效应性T 细胞增殖明显，调节性T 细胞比例明显下降，与学者证实肾移植急性排斥反应肾小管损害负相关一致［15-17］。说明阻断PD-1／PD-L1信号通路加重肾移植急性排斥反应，在其中起到重要作用。

雷公藤甲素是传统中药雷公藤的提取物，是雷公藤提取物中抑制已经活化的T 细胞最强的单体，而对处于静止期的T 细胞作用并不显著［3-4］。实验证明，雷公藤甲素可通过多条途径对于T 细胞的产生抑制作用，对多种T 淋巴细胞存在抑制作用，同时有提升对调节性T 细胞的作用［3-4，18-19］。本实验结果表明，雷公藤甲素组大鼠肾脏组织中PD-L1表达显著增加，抑制效应性T 细胞CD3＋T 细胞、CD4＋T 细胞、CD4＋／CD8＋，CD8＋T 细胞、CD4＋CD25＋调节性T 细胞显著上升，从而使大鼠生存状态最好，存活时间最长，肾功能状态最佳，急性排斥反应分级最轻，证实雷公藤甲素可使PD-L1的表达增强和增加调节性T 细胞的比率，抑制效应性T 细胞活化，从而在抗排斥反应中起到良好效果。

PD-L1和CD4＋CD25＋调节性T 细胞在T 细胞的活化、增殖、凋亡方面有密切的联系，研究证实PD-1和PD-L1在Treg 上均有高表达，对诱导调节性T 细胞的产生作用重大［20-21］。CD4＋CD25＋调节性T 细胞表达多种表面分子，主要包括抑制性共刺激分子CTLA-4、PD-1等抑制免疫反应并且诱导和维持免疫耐受［20-22］。曾有报道应用PD-L1单抗阻断PD-1／PD-L1通路后抑制了CD4＋CD25＋调节性T 细胞的功能［20，23］。本实验发现雷公藤甲素可增加PD-L1表达，增加调节性T 细胞，从而减轻肾移植的排斥反应，且另一组大鼠给予雷公藤甲素及anti-mouse PD-L1的腹腔灌注，阻断了PD-1／PD-L1。不论是大鼠生存状态，肾功能，存活时间，急性排斥反应病理分级，还是效应性T 细胞增殖，调节性T 细胞的比率等情况均差于雷公藤甲素组，却好于anti-PD-L1组，说明阻断PD-1／PD-L1通路降低了调节性T细胞比率，减弱了其效能，使雷公藤甲素的抗排斥效果显著下降，推测CD4＋CD25＋调节性T 细胞是PD-1／PD-L1信号通路介导的雷公藤甲素抗肾移植急性排斥反应的重要靶点及机制。证明雷公藤甲素在缓解肾移植急性排异反应中PD-1／PD-L1信号通路是其发挥抗排斥反应的重要信号通路之一。

综上所述，本研究证实，雷公藤甲素可上调PD-L1基因表达，增加调节性T 细胞的比率，抑制效应性T 细胞的增殖，抑制移植排斥反应，延长移植物的存活时间。PD1／PD-L1可能在雷公藤甲素抗排斥反应信号通路中发挥一定作用，CD4＋CD25＋调节性T 细胞可能是PD-1／PD-L1信号通路介导的雷公藤甲素抗肾移植急性排斥反应的重要靶点。