姜黄素通过IL-6/STAT3信号通路调控Th17/Treg平衡治疗溃疡性结肠炎*

陈光华, 陈教华， 张磊昌

(江西中医药大学附属医院肛肠科， 江西 南昌 330006)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性非特异性肠道疾病，病程漫长，反复发作，发病率呈现出逐年上升的趋势[1]。UC的病因十分复杂，发病机制尚不十分明确，但多数学者认为UC是一种自身免疫性疾病[2-3]。Fonseca-Camarllo等[4]发现,辅助性T细胞17(T helper 17 cells，Th17)和调节性T细胞(regulatory T cells， Treg)比例失衡引起的促炎/抑炎因子失衡是UC的发病机制之一。这2个T细胞亚群在免疫功能中发挥了重要作用，Th17可分泌促炎因子白细胞介素17(interleukin-17, IL-17)，促进肠道炎症发生，而Treg细胞可抑制炎症反应。研究证明，IL-6在调节Th17和Treg细胞之间的平衡中起重要作用，IL-6和转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)诱导Th17细胞的发育；相反，IL-6抑制TGF-β诱导的Treg分化[5]。现在医学研究也已经证实了IL-6/STAT3信号通路在UC的发生和发展中起重要作用，可通过靶向阻断IL-6/STAT3信号通路来治疗UC疾病[6-7]。近年来，大量研究证实姜黄素对UC具有治疗作用，但具体的作用机制尚不十分明确。本研究将姜黄素用于治疗葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)诱导的UC模型小鼠，并通过检测IL-6、STAT3及p-STAT3蛋白的水平，以及Th17和Treg细胞的水平及相关转录因子的表达，来探究姜黄素是否通过IL-6/STAT3信号通路调控Th17/Treg平衡以有效治疗UC，进一步探讨姜黄素治疗UC的作用机制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1动物 健康SPF级雌性BALB/c小鼠50只，鼠龄6～7周，体质量18～22 g，购于重庆腾鑫生物技术公司，许可证号为SYXK(渝)2018-005。

1.2药物与试剂 DSS和姜黄素(Sigma)；小鼠抗IL-6单克隆抗体(批号ab9324)、兔抗STAT3单克隆抗体(批号ab68153)和兔抗磷酸化STAT3(p-STAT3)单克隆抗体(批号ab76315)(Abcam)；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜(Millipore，GS0914，0.45 μm)；II 抗Goat anti-Rabbit IgG(Jackson，批号03118A)；化学发光剂AB液(Thermo)；CD4-PerCP、CD25-APC、CD45RA-PE、IL-17-Alexa Fluor®488(BD PharmingenTM)；FoxP3-PE-Cyanine7(eBioscience)；CD3e-PE-CF594和CD8a-BV510(BD HorizonTM)；BCA蛋白定量试剂盒(Thermo scientific)；兔抗大鼠FOXP3、RORγt和β-actin多克隆抗体(Santa Cruz)。

1.3仪器 CKX41光镜(Olympus)；Chemidoc XRS化学发光成像系统(Bio-Rad)；RM2145切片机(Leica)；多功能酶标仪(BioTek)；流式细胞仪(Beckman)。

2 方法

2.1分组及建模 50只健康雌性BALB/c小鼠随机分为5组，每组10只。正常对照组每日自由进饮用水，每日腹腔注射1 mL生理盐水，共7 d；模型组每日自由饮用5% DSS溶液，每日腹腔注射1 mL的25 mL/L乙醇溶液，共7 d；姜黄素低剂量组饮用5% DSS溶液，每日腹腔注射姜黄素悬液1次(按15 mg/kg的剂量溶于25 mL/L乙醇1 000 μL)，共7 d；姜黄素中剂量组饮用5% DSS溶液，每日腹腔注射姜黄素悬液1次(按60 mg/kg的剂量溶于25 mL/L乙醇1 000 μL)，共7 d；姜黄素高剂量组饮用5% DSS溶液，每日腹腔注射姜黄素悬液1次(按120 mg/kg的剂量溶于25 mL/L乙醇1 000 μL)，共7 d。于末次给药结束后，禁食12 h后全部处死小鼠，收集结肠组织，分别置于4%多聚甲醛固定，液氮中备用。

2.2结肠组织的病理学评分 取出小鼠结肠组织用4%多聚甲醛固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(3 μm)，液氮中备用。遵循HE染色步骤，在光镜下观察、拍照并进行病理学评分。具体评分标准见表1。

2.3Western blot法检测IL-6、STAT3、p-STAT3、RORγt和FOXP3的蛋白水平 将结肠组织置于匀浆器内同时加入400 μL RIPA裂解液(含PMSF)于冰上匀浆30 min，将裂解液移至1.5 mL离心管中，于4 ℃、12 000 r /min离心5 min，-80 ℃保存上清，Lowry法测定总蛋白量。每个样品取10 μL并加入等量的2×loading buffer，金属浴98 ℃ 10 min。SDS-PAGE每孔上样15 μL，结束后将蛋白转移至PVDF膜，膜用5%脱脂奶粉+1% BSA室温封闭1 h，按1 ∶1 000加入 I 抗，4 ℃摇床过夜，TBST洗3次，每次10 min；按1 ∶5 000加入II抗，室温反应1 h，TBST洗3次，每次15 min；等体积混合ECL AB液，与PVDF膜共孵育1 min，放入Bio-Rad化学发光仪曝光，以GAPDH为内参照。

表1 组织损伤评分的标准

2.4Th17和Treg细胞水平的检测 提取小鼠结肠固有层黏膜单个核细胞：取小鼠结肠组织，冰PBS冲洗肠内容物，剖开肠道，剪成4～5 cm的片段；放入10 mL 去Mg2+、Ca2+的HBSS孵育液(含1 mmol/L-DTT、1 mmol/L-EDTA和10% FBS)，37 ℃摇床40 r/min孵育20 min(2次)去除黏液和上皮细胞；用眼科剪将组织尽量剪碎，放入5 mL含0.5 g/L collagenase D、0.5 g/L DNase I、3 g/L dispase Ⅱ及10% FBS的DMEM培养基中，37 ℃摇床100 r/min消化15～20 min，将消化好的细胞悬液经200目细胞过滤筛滤过，若组织没消化完全，再重新加入消化液重复1次；细胞悬液离心300×g10 min，弃上清，加入5 mL DMEM重悬细胞， 300×g离心10 min，沉淀用8 mL 40% Percoll重悬；取15 mL离心管底部加入4 mL 80% Percoll，用枪头吸取细胞悬液小心铺于表面，密度梯度离心800×g离心 20 min；把界面层细胞吸入新15 mL离心管，加入10 mL PBS， 300×g离心10 min,弃上清；再用PBS重悬后进行台盼蓝染色和细胞计数、备用。在24孔培养皿中加入2 μL白细胞混合刺激剂/106个细胞，放入5% CO2、37 ℃恒温箱培养5 h，室温避光与抗CD4、CD25和CD45RA抗体孵育15 min；按照操作手册细胞破膜后避光与抗FOXP3和IL-17抗体孵育20 min，上流式细胞仪检测Treg细胞及Th17细胞的水平。

3 统计学处理

全部资料应用SPSS 19.0软件进行统计分析。实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)及SNK-q检验，以P<0.05 表示差异有统计学意义。

结 果

1 小鼠结肠组织病理学评分

正常对照组结肠组织结构完整，腺体排列整齐，隐窝正常，杯状细胞无减少，未见黏膜糜烂、出血，未见炎性细胞浸润；模型组结肠黏膜结构破坏严重，腺体排列紊乱或缺失，腺腔不规则扩张，黏膜及黏膜下层血管高度扩张、充血，溃疡巨大、深达肌层，以中性粒细胞和淋巴细胞为主的炎性细胞浸润；姜黄素中剂量组小鼠结肠腺体破坏较轻，结构基本恢复正常，炎性细胞浸润深度较模型组明显变浅，炎性细胞数量也显著减少，炎症程度明显减轻；姜黄素低剂量组和高剂量组可见黏膜少量修复，腺体排列不整齐，大量炎性细胞浸润，与模型组相比略有减轻，说明低剂量和高剂量的姜黄素对UC疾病没有很好的治疗效果，见图1。

病理学评分结果显示模型组小鼠组织损伤评分显著高于正常组(P<0.05)；与模型组比较，姜黄素中剂量组病理评分大幅度降低(P<0.05)；姜黄素低剂量组、高剂量组和模型组之间的评分差异无统计学显著性(P>0.05)，见表2。

2 姜黄素对小鼠结肠组织IL-6、STAT3和p-STAT3蛋白水平的影响

模型组小鼠结肠组织IL-6、STAT3和p-STAT3的蛋白水平均较正常组显著增高(P<0.05)；姜黄素中剂量组IL-6、STAT3和p-STAT3的蛋白水平均较模型组明显降低(P<0.05)；姜黄素低剂量组和高剂量组与模型组之间蛋白水平的差异无统计学显著性(P>0.05)，见图2。

3 姜黄素对小鼠结肠固有层黏膜Th17和Treg细胞水平的影响

模型组的Th17细胞水平最高，Treg细胞的水平最低。与模型组相比，中剂量姜黄素可显著降低Th17细胞的水平，而显著升高Treg细胞的水平(P<0.05)，使其接近正常组水平；姜黄素低剂量组和高剂量组的Th17和Treg细胞水平均接近模型组，差异无统计学显著性(P>0.05)，见图3、表2。

4 姜黄素对小鼠结肠组织RORγt和FOXP3蛋白表达的影响

模型组小鼠结肠组织中RORγt蛋白的表达显著高于正常组，而FOXP3的表达显著低于正常组(P<0.05)；与模型组相比，中剂量的姜黄素能有效降低RORγt的蛋白表达，并且显著升高FOXP3的表达(P<0.05)，接近正常组水平；姜黄素低剂量组和高剂量组RORγt和FOXP3的蛋白表达水平接近模型组，差异无统计学显著性(P>0.05)，见图4。

Figure 1.Colonic histopathological changes of mice in each group (×200).

图1 小鼠结肠组织的组织病理学观察

表2 小鼠结肠组织的组织病理学评分和结肠固有层黏膜Th17和Treg细胞水平的比较

Table 2.Comparisons of the histological score and the levels of Th17 and Treg in the colon tissues of the mice in each group (Mean±SD.n=10)

GroupHistological scoreTh17 (%)Treg (%)Normal control01.72±0.70 10.16±0.95 UC model6.28±0.15∗4.32±0.57∗7.28±1.30∗Curcumin (low dose)5.46±0.22∗4.08±0.62∗7.35±0.83∗Curcumin (medium dose)1.25±0.12#2.03±0.31#9.88±0.92#Curcumin (high dose)2.83±0.13#3.96±0.75∗7.40±1.28∗

*P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vsUC model group．

讨 论

UC是炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)的一种常见类型，发病机制较复杂，免疫反应异常在UC发生中起重要作用[8-9]。CD4+T细胞亚群在免疫调节方面具有至关重要的作用，Th17细胞是新型CD4+T细胞亚群，在诱导自身免疫性疾病中发挥重要作用，RORγt是其特有转录因子。Th17可分泌IL-17A(IL-17)、IL-17F、IL-22、IL-6和TNF-α多种效应因子，IL-17可通过诱导趋化因子和多种促炎细胞因子(比如IL-6和TNF-α)来介导炎症反应，参与自身免疫性疾病的发生[10]。此外，Treg在维持免疫稳态和预防自身免疫性疾病方面发挥着关键作用，能够抑制自身免疫的发生，FOXP3是其标志性转录调控因子，Treg通过分泌IL-4、IL-10和TGF-β等细胞因子来参与多种免疫性疾病[11]。

在我们的研究中证实，与模型组相比，中剂量姜黄素可显著降低Th17细胞水平，而显著升高Treg细胞水平，中剂量的姜黄素能有效降低RORγt的表达，并且显著升高FOXP3的表达。近年来研究发现，Th17和Treg之间的平衡对免疫稳态至关重要，且Th17和Treg在分化过程中可进行相互转化[12-13]，我们的研究发现姜黄素在这个过程中发挥着一定的作用。Yang等[14]研究发现在DSS诱导的UC模型小鼠中Th17和Treg细胞的比例都是升高的，在UC中存在Th17和Treg的免疫失衡。因此，调控Th17和Treg的平衡是治疗IBD的有效方法。近期研究发现，姜黄素对IBD模型小鼠具有很好的疗效[15-16]。姜黄素具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等作用，但对IBD的作用机制尚不明确。庞艳华等[17]研究认为，姜黄素治疗DSS诱导的UC小鼠的可能机制是抑制NF-κB及细胞因子TNF-α和IL-6等的表达。我们推测，姜黄素可有效促进Treg的转录因子FOXP3的表达而抑制Th17的转录因子RORγt的表达，从而调节Th17/Treg的分化平衡缓解UC小鼠的炎症反应。

Figure 2.Western blot analysis of IL-6, STAT3 and p-STAT3 protein expression levels in each group. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vsUC model group.

图2 Western blot检测小鼠结肠组织IL-6、 STAT3 and p-STAT3的蛋白水平

Figure 3.The images of flow cytometry for analyzing the levels of Th17 and Treg cells in the lamina propria mucosa of the colon in the mice of each group.

图3 流式细胞术分析小鼠结肠固有层黏膜Th17和Treg细胞的水平

Figure 4.Western blot analysis of FOXP3 and RORγt protein expression levels in each group. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vsUC model group.

图4 Western blot检测小鼠结肠组织FOXP3和RORγt的蛋白水平

在我们的实验中发现，与模型组相比，姜黄素中剂量组IL-6、STAT3和p-STAT3的蛋白水平均明显降低，接近正常组。IL-6是一种多效细胞因子，在许多免疫系统中起重要作用，可以调节多种免疫细胞的增殖和分化。IL-6因在Th17和Treg分化及相互转化过程中起关键作用而在UC中起调节炎症的作用，IL-6的过度表达会导致Th17和Treg细胞之间的分化失衡，已有研究表明，控制IL-6的表达会调节Th17介导的免疫反应。Bromberg等[18]研究发现，在UC模型小鼠结肠固有层黏膜中存在Th17/Treg细胞的失衡，并且IL-6的水平是升高的，认为是IL-6的局部水平升高参与了两者之间的分化失衡从而导致了UC小鼠的免疫失衡。IL-6可与受体结合形成IL-6/sILR复合物形式，复合物与膜糖蛋白gp130相互作用，使与gp130组成性相关的JAK激酶磷酸化，从而使STAT3的表达增加，活化的JAK可使STAT3发生磷酸化而被激活，转移到细胞核中后调节下游基因的表达，导致炎症的发生[19]。目前，通过靶向阻断IL-6/STAT3信号通路可以有效预防和治疗UC疾病。Chen等[20]研究证实在DSS结肠炎模型中，IL-6和STAT3表达水平均升高，并且随着病程程度的增加而增加。我们推测，本研究结果说明姜黄素可通过对该通路的调节而发挥对UC的治疗作用。

本研究发现UC模型组中IL-6、STAT3和p-STAT3的蛋白水平较高，并且 Th17/Treg比例是失衡的，中剂量姜黄素治疗后，蛋白水平下降，接近正常组水平，Th17/Treg的比例恢复平衡。因此，姜黄素可能通过IL-6/STAT3信号通路调控Th17/Treg的平衡来治疗溃疡性结肠炎。本研究为明确姜黄素治疗UC的作用机制提供了理论依据。