棉叶中棉酚快速测定方法的改进

方丹，邢荣花，徐双娇，马磊

（1.中国农业科学院棉花研究所/ 农业农村部棉花产品质量安全风险评估实验室（安阳），河南安阳455000；2.中华人民共和国安阳海关，河南安阳455000）

棉酚（G）及相关物甲氧基半棉酚（DHG）、半棉酚酮（HGQ）、半棉酚（HG）、杀实夜蛾素（H1-4）等是棉花中重要的抗虫性萜烯类次生物质[1]，广泛存在于棉族植株各部位的褐色点状色素腺体中。国内外对棉花抗虫萜烯类化合物种类和抗虫性能的研究表明，棉叶色素腺体内的棉酚及其衍生物有助于棉花植株适应不良环境，对棉花的多种病原菌和害虫具有拮抗作用。 研究发现，棉酚在医药等领域有重要的应用价值，表现出抑制精子产生和抗肿瘤作用，同时具有较强的毒副作用。

通常在棉花组织中呈游离状态的棉酚称为游离棉酚，与其他物质（主要是蛋白质）结合的称为结合棉酚。至今已报道的游离棉酚的测定方法有比色法[2]、薄层色谱法[3]、紫外 - 可见分光光度计法[4-5]、核磁共振法（Nuclear magnetic resonance，NMR）[6-7]、高效液相色谱法 （High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[8-10]、 高效液相色谱 - 质谱检测法（HPLC-MS）[11-12]。 其中棉酚提取后与某种试剂发生反应，以分光光度计测定样品溶液的吸光度对棉酚进行定性和定量分析的方法主要有间苯三酚法和苯胺法。Smith-苯胺法利用芳烃环上的醛基与苯胺反应生成黄色物质进行比色测定。高效液相色谱法，样品中的棉酚被提取净化后，不需要进行衍生化，可直接上机测定，是目前最常用的方法。我国于2014年发布了GB 5009.148—2014《食品安全国家标准 植物性食品中游离棉酚的测定》，该标准适用于植物油或以棉籽饼为原料的其他液体食品中游离棉酚的测定[13]。 施琦贻[14]报道了以HPLC-ESIMS/MS 联用技术检测蛋黄中棉酚残留的研究，样品经丙酮提取后，以甲醇和1%（体积分数）甲酸为流动相，采用电喷雾负离子模式离子化、多反应监测模式测定棉酚。 然而对于不同样品基质，提取溶剂的选取也会有所差别，导致棉酚提取率及测定结果存在差异。 因此，本研究着重对棉叶样品的提取方法进行讨论并筛选出一种简单、快速的前处理方法，比较2 种测定方法，即紫外- 可见分光光度计法（Smith-苯胺法）和HPLC 法，通过分析测定结果的差异，建立准确测定棉叶中棉酚的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

安捷伦1100 型高效液相色谱仪，DAD 检测器，反相色谱柱：Eclipse Plus C18 柱 （填料粒径 5 μm，内径 4.6 mm，长度 250 mm），岛津 UVmini-1240 紫外- 可见分光光度计，超声清洗器，振荡器，离心机，水浴锅。

棉酚标准品，购自Sigma 公司 （批号G8761-（±）-gossypol from cotton seeds，≥95%），所用试剂甲醇、丙酮、乙腈、乙醇、磷酸均为色谱纯试剂，购自Sigma 公司，溶液 A（715 mL 乙醇，加冰醋酸 0.2 mL及乙醚200 mL，用超纯水稀释至1 000 mL），溶液B（3 g 抗坏血酸溶于 45 mL 溶液 A），苯胺（重蒸），试验均采用MiliQ 超纯水。

1.2 植株材料

供试样品采自试验田棉花，品种为石抗-126，种植于河南省安阳县，常规管理。

棉叶样品采集后，液氮研磨真空干燥脱水备用。

1.3 色谱条件

HPLC 法，流动相为甲醇与0.1%（体积分数）磷酸混合液（体积比 85∶15），等度洗脱；流速：1.0 mL·min－1；检测波长：235 nm；柱温：40 ℃；进样量 10 μL。

1.4 棉酚标准品溶液的制备

称取棉酚标准品50 mg，用乙腈溶解，定容至50 mL 棕色容量瓶中，得到质量浓度为1 000 mg·L－1的棉酚标准储备液，4 ℃冰箱避光保存。

1.5 HPLC 法

1.5.1提取溶剂的对比试验。根据相似相容原理，在棉酚前处理过程中，采用有机溶剂来提取棉酚，分别以纯丙酮、 乙腈/ 水/ 磷酸混合液 （体积比80∶20∶0.1）、正己烷 / 乙酸乙酯 / 乙酸混合液（体积比500∶500∶1）、异丙醇 / 正己烷混合液（体积比60∶40）为提取溶剂，进行对比测定。

1.5.2测定过程。称取粉碎样品100 mg （精确至0.000 1 g）于离心管中，加入2 mL 提取溶剂——乙腈 / 水 / 磷酸混合液（体积比 80∶20∶0.1），超声提取15 min，提取液离心分离，经孔径0.22 μm 微孔滤膜过滤，滤液按照“1.3 色谱条件进样10 μL”测定。

1.6 紫外-可见分光光度计法（Smith-苯胺法）

称取粉碎样品100 mg （精确至0.000 1 g）于250 mL 带塞锥形瓶中，加入 3 mL 溶液 B 和 0.5 mL 浓盐酸，混匀，再加入 20 mL 玻璃珠（直径6 mm），3 min 后叶绿素褪色，加入 30 mL 乙醚后置于水浴中至沸腾，除去瓶中空气，迅速加盖瓶塞并振荡10 min，减压抽滤，滤液收集于50 mL 容量瓶中，用溶液A 稀释至刻度，快速量取此液5 mL（3份），同时取 5 mL 溶液 A（3 份），置于 25 mL 容量瓶中，向其中2 份中加入0.5 mL 苯胺（重蒸），第三份作为参比溶液，一并置于75 ℃水浴中加热40 min，冷却后，用溶液A 将3 份溶液稀释至刻度，在最大吸收波长445 nm 处进行比色测定[15]。

2 结果与分析

2.1 HPLC 法

2.1.1提取溶剂效果对比。常温下，棉酚标准品呈黄色粉末，易溶于乙醇、乙醚、丙酮和三氯甲烷等有机试剂，不易溶于水及低沸点的石油醚、己烷[16]。棉酚溶液稳定性差，极易被氧化而变质。 因此，在测定棉酚的过程中，选用不同的提取溶剂[17]对比效果。测定结果（表1）表明，以乙腈/ 水/ 磷酸为提取溶剂时，提取效率最好，所得棉酚含量最高。 另外，棉酚在乙腈中的稳定性比较好，该提取溶剂与流动相互溶性好，提取后可直接测定，避免氮气吹干复溶时，目标物的损失； 因此最终确定乙腈/ 水/磷酸混合液（体积比80∶20∶0.1）为合适的提取溶剂。

在以上确定的提取与色谱条件下，与棉酚标准品图谱相比，以确定棉酚的峰，结果见图1。

表1 不同提取溶剂下棉酚测定结果的对比

图1 棉酚HPLC 检测图谱

2.1.2标准曲线和灵敏度（外标法）。精密吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 棉酚标准储 备液 （1 000 mg·L－1） 于 10 mL 棕色容量瓶中，用乙腈稀释定容，得到质量浓度分别为 20、30、40、50、60、70 mg·L－1的标准溶液，按照“1.3 色谱条件”进行检测，对峰面积y与质量浓度x进行线性回归，得回归曲线（图 2），其回归方程为y＝167.75x－330.34，r＝0.999 5，表明棉酚在上述质量浓度范围内线性良好。 棉酚的最低检出限为 0.475 mg·L－1。

2.1.3精密度试验。取 40 mg·L－1的棉酚标准溶液，按“1.3 色谱条件”进行分析，在同一条件下连续进样 5 次，得到棉酚峰面积为 6 227.6、6 192.2、6 232.5、6 235.9、6 095.7，平均值为 6 196.8，相对标准偏差（RSD）为 0.95%（n＝5），表明本试验方法精密度良好。

图2 棉酚标准品的标准工作曲线

2.1.4平行性与重复性测定。称取6 份冷冻干燥后的样品各100 mg，以上述乙腈/ 水/ 磷酸混合液为提取剂，振荡、超声15 min 提取，离心分离后，取上清液过孔径0.22 μm 的微孔滤膜，上机测定棉酚的含量，所得数据如表2，表明该方法重复性好。

表2 棉酚HPLC 法平行性的测定结果

2.1.5稳定性试验。取待测样品溶液，室温下，分别在 0、1、3、6、10、12 h 依次测定，记录峰面积分别为4 224.9、4 223.4、4 149.2、4 107.5、4 036.8、4 022.4，结果RSD为 2.13%（n＝6）。

2.1.6加标回收率测定。精确称取6 份已知棉酚含量的样品 100 mg，分成2 组，每组3 个平行，每组分别加入棉酚标准品 0.04 mg、0.06 mg、0.10 mg 进行测定，从标准曲线上查得加标后棉酚浓度，进而得到其含量值，按下式计算回收率，所得回收率为80.15%～113.00%（表 3）。

加标回收率（%）＝（样液加标后测定值－样液测定值）/加标量×100%。

表3 棉酚回收率的测定（HPLC 法）结果

2.2紫外-可见分光光度计法。按照1.6 所述方法对棉叶样品进行提取和测定，选择不同的提取溶剂[纯丙酮、正己烷 / 乙酸乙酯 / 乙酸（500∶500∶1）、异丙醇/ 正己烷（60∶40）、溶剂A]对比结果表明，以溶剂A 作提取溶剂时所得吸光度值最大，所得结果见表4。

表4 紫外-可见分光光度计法平行性的测定结果

3 讨论与结论

棉花抗虫萜烯类化合物是棉花自身重要的防御物质。 在国内外以往的一些研究报道中，关于棉花植株在一定生长时期及主要器官中棉酚、半棉酚酮等萜烯类物质的含量测定很多，如Mahoney 等[18]和Stipanovic 等[1]采用液相色谱法，对棉叶、花蕾及棉籽仁进行提取、净化、浓缩等前处理，测定萜烯类物质含量，结果显示棉叶中主要含有半棉酚酮和杀实夜蛾素，棉籽中只存在棉酚，花蕾中主要含有棉酚。 Benson 等[19]采用乙腈/ 水作为提取溶剂，不需要进行净化、浓缩步骤，采用内标法测定棉株绿色组织和花蕾中萜烯类物质的含量，建立了快速、可靠、稳定的测定方法。

本研究数据表明，Smith- 苯胺法测定结果与HPLC 法测定结果存在明显差异。 Smith-苯胺法测定速度快、成本低，是利用棉叶中具有芳香醛结构的化合物与苯胺反应形成黄色物质进行比色测定，对棉酚不具有专一性，因此其结果反映棉叶中萜烯类物质的总和，数值偏高；而HPLC 法测定的是棉叶萜烯类物质中棉酚的含量。 所以，对于棉叶中棉酚物质的检测，HPLC 法是比较可靠的分析方法。

棉酚分子中含有多个酚羟基，具有弱酸性，在流动相中加入少量磷酸，才能获得峰形对称的色谱峰。 本研究采用乙腈/水/磷酸混合液提取棉叶中的棉酚用于HPLC 分析，选择甲醇/0.1%（体积分数）磷酸（体积比85∶15）为流动相，不需要样品的净化、浓缩步骤，方法简便、快速、稳定。棉叶样品色谱图（图1-B）中，除了棉酚，还有一个标注“1”的峰，通过液质联用仪分析，该物质是半棉酚酮，对此需要进一步的研究验证，以期为棉花抗虫和育种工作者提供技术支持。