白细胞介素-6中和抗体对小鼠缺血性脑损伤的影响

周雨曦 闻大翔 俞卫锋 杭燕南

急性缺血性脑卒中为最常见的脑卒中类型，且溶栓治疗窗短，因此患者极易发生远期神经功能障碍，如肌力降低、认知障碍等问题。当脑血管急性堵塞时，中心区域为完全梗死区，而周边脑组织发生急性炎性反应，若未得到及时有效的治疗，会发生坏死加重损伤。抗炎治疗可针对梗死区周边脑组织产生保护作用，是重要的治疗方法［1］。研究［2-3］结果表明，缺血性脑卒中患者血清IL-6水平升高，且IL-6水平与患者的脑梗死体积、不良预后呈正相关。本研究旨在探讨IL-6中和抗体处理对缺血性脑卒中小鼠的脑梗死体积、脑组织急性炎性反应和脑梗死长期预后（脑梗死后28 d）的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物和材料 健康成年雄性C57小鼠（清洁级）60只，平均体重为（30±5）g，由原第二军医大学动物中心提供。吸入麻醉药七氟烷为上海恒瑞医药有限公司产品，IL-6中和抗体（MP5-20F3）和IgG同源对照抗体均为美国赛默飞世尔科技（中国）有限公司产品，CD3兔抗小鼠中和抗体为艾博抗（上海）贸易有限公司产品，Iba-1兔抗小鼠中和抗体为日本和光纯药工业株式会社产品。小动物麻醉机为美国肯特科技公司产品，冰冻切片机为美国赛默飞世尔科技（中国）有限公司产品，荧光显微镜为德国卡尔·蔡司股份公司产品。

1.2 实验小鼠的饲养和分组 将60只小鼠随机分为假手术组、IL-6中和抗体处理组和IgG对照组，每组20只。小鼠手术前后均于实验室动物房内饲养，自由饮食，室温维持20～22℃，每12 h日夜交替。

1.3 小鼠脑缺血模型制作和分组处理 用体积分数为0.02的七氟烷、0.30的氧气和0.68的一氧化二氮混合气体麻醉小鼠，用小动物麻醉机控制呼吸，温控加热板将小鼠术中直肠温度维持于（37.0±0.5）℃。IL-6中和抗体处理组和IgG对照组小鼠行大脑中动脉远端栓塞术，取颈部正中切口，分离迷走神经，结扎左侧颈总动脉，缝合颈部切口；在小鼠左眼与左耳之间切开皮肤约1 cm，使用双极电凝器游离颞肌，用颅钻切开颅骨暴露大脑中动脉；随后移除脑膜，使用双极电凝器凝断远端大脑中动脉及其分支。假手术组小鼠采用同样的麻醉和手术方法，但不阻断颈总动脉和大脑中动脉［4］。术后2 h，IL-6中和抗体处理组小鼠于腹腔内注射IL-6中和抗体600μg／kg，IgG对照组小鼠于腹腔内注射IgG同源对照抗体600μg／kg。

1.4 计算脑梗死体积 每组取6只小鼠，在术后3 d断头取脑，去除嗅球和脑干部分，置于冠状脑模具中连续切成1 mm脑片，共7片。将切片置于2%氯化三苯四氮唑（TTC）溶液中孵育30 min，4%多聚甲醛溶液固定，无法被TTC染色的白色区域为缺血梗死区。应用Image J软件计算梗死面积，梗死体积=梗死面积×脑片厚度（1 mm）。校正脑水肿后的实际脑梗死体积=梗死对侧半球体积-梗死同侧非梗死区域体积。

1.5 免疫荧光染色和荧光显微镜观察 每组取4只小鼠，在术后3 d用2%戊巴比妥麻醉，经左心室快速灌注0.9%氯化钠溶液40 m L后，继续灌注4%多聚甲醛溶液40 m L。目前已知，脑组织中固有的小胶质细胞和外周浸润的T淋巴细胞是受损脑组织炎性细胞因子的主要来源。采用CD3抗体标记T淋巴细胞，Iba-1抗体标记小胶质细胞。取脑组织依次置于20%蔗糖溶液和30%蔗糖溶液中至脑组织沉底，1 d后行冰冻切片，厚度为25μm。以5%牛血清白蛋白室温封闭脑片1 h，加入CD3抗体（1∶200）、Iba-1抗体（1∶1 000），于4℃孵育过夜，室温漂洗后加入驴抗兔红色荧光二抗稀释液（1∶1 000），再室温孵育2 h，漂洗后贴片、晾干后4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）封片。于荧光显微镜下观察并拍摄有效图像，计数脑梗死周边区域阳性细胞数。

1.6 行为学评估

1.6.1 神经功能评分 每组各取10只小鼠，分别于脑卒中术前和术后3、5、7、14、21、28 d，采用改良Garcia评分从肢体感觉、爬行能力、转向能力、肢体对称性和前肢运动能力5个方面进行评分，每项0～3分，神经功能总评分15分，得分越低提示神经损伤越严重［5］。

1.6.2 感觉运动功能测试 每组取进行神经功能评分的10只小鼠行黏纸实验，均以相同的压力在小鼠的损伤侧前爪粘贴大小为0.3 cm×0.4 cm的黏纸，随后将小鼠放于透明观察盒中，记录小鼠感知和撕除黏纸的时间，最长时限为120 s。缺血性脑卒中后，小鼠感觉运动功能受损，感知并撕除黏纸所需时间延长，时间越长提示感觉运动功能受损越严重。小鼠术前连续3 d每天训练1次，记录基础值，测试当日测试1次，记录每周3个测试日数据的平均值作为该周感觉运动功能的评估指标［6］。在造模后第3～5天（第1周）、第10～12天（第2周）、第17～19天（第3周）、第24～26天（第4周）对小鼠进行感觉运动功能测试，计算术后第1～4周感觉运动功能的评估指标。

1.7 统计学处理 应用SPSS 22.0统计学软件。呈正态分布的计量资料以x-±s表示，呈非正态分布的计量资料以中位数和四分位数表示。组间比较采用单因素方差分析或重复测量数据的方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 脑梗死体积比较 术后3 d，假手术组、IL-6中和抗体处理组和IgG对照组的脑梗死体积分别为0.45（0，1.05）、（14.9±2.2）和 （18.0±1.4）mm3，IL-6中和抗体处理组和IgG对照组均显著大于假手术组（P值均＜0.01），但IL-6中和抗体处理组显著小于IgG对照组（P＜0.05）。

2.2 脑梗死周边区域炎性细胞比较 术后3 d，IL-6中和抗体处理组脑梗死周边区域CD3+细胞数目和Iba-1+细胞数目分别为（27.06±3.01）和（56.81±3.47）个／mm3，IgG 对 照 组 分 别 为（51.73±3.99）和（99.88±3.63）个／mm3，IL-6中和抗体处理组脑梗死周边区域CD3+细胞数目和Iba-1+细胞数目均显著少于IgG对照组（P值均＜0.05）。见图1。

图1 IL-6中和抗体处理组和IgG对照组小鼠术后3 d脑组织免疫荧光染色结果

2.3 神经功能评分比较 3组小鼠术前的神经功能总评分的差异均无统计学意义（P值均＞0.05）。在术后3、5、7、14、21、28 d，IgG 对照组和IL-6中和抗体处理组小鼠的神经功能总评分均显著低于假手术组（P值均＜0.01）。在术后5、7、14、28 d，IL-6中和抗体处理组小鼠的神经功能总评分均显著高于Ig G对照组（P值分别＜0.01、 0.05）。见表1。

表1 3组小鼠脑缺血后神经功能总评分比较（N=10，x-±s，分）

2.4 黏纸实验结果比较 3组小鼠术前撕除黏纸时间的差异均无统计学意义（P值均＞0.05）。术后第1、2、3、4周，IgG对照组小鼠撕除黏纸时间均显著长于假手术组（P值分别＜0.01、0.05）。术后第1周，IL-6中和抗体处理组小鼠撕除黏纸时间显著长于假手术组（P＜0.01）。术后第1、2周，IL-6中和抗体处理组小鼠撕除黏纸时间均显著短于IgG对照组（P值均＜0.01）。见表2。

表2 3组小鼠撕除黏纸时间比较（N=10，x-±s，s）

3 讨 论

国内外研究结果表明，急性脑卒中患者血清IL-6水平升高［3，7］，且脑卒中患者发病6 h内脑脊液中IL-6水平与24 h脑梗死体积呈正相关［8］，提示IL-6参与了损伤早期的急性炎性反应。IL-6水平与多种循环和神经系统疾病相关，心房颤动患者的IL-6水平与脑卒中和大出血相关，也是血栓形成和死亡的危险因素［9］；IL-6水平高的中年患者较IL-6水平低者，在10年内更易发生认知功能下降［10］。尽管升高的IL-6水平与脑卒中后致死致残率相关，但亦有研究结果表明IL-6可在脑卒中后发挥神经保护功能，这提示外周和中枢系统的IL-6可能在不同时间点发挥不同的作用。

IL-6与其受体结合后可激活两种细胞内信号通路——经典信号通路和反式信号通路，从而产生不同的生物学反应。经典信号通路可发挥抗炎、促细胞新生和神经保护作用，而反式信号通路具有促炎效应。缺血性脑梗死发生后，多效性细胞因子IL-6激活后的生物学效应复杂且尚未完全阐明，主要包括促炎和营养神经两方面效应：①在脑梗死急性期可作为促炎细胞因子上调黏附分子表达促进淋巴细胞募集，加重脑组织损伤；②在脑梗死亚急性期和远期，可作为神经营养因子，促进血管和神经元新生［11］。在脑梗死的不同临床分期，通过干预IL-6对预后产生影响仍存在争议。近期研究［12］结果表明，单纯静脉注射IL-6细胞因子可改善缺血性脑卒中小鼠的运动功能，IL-6和可溶性IL-6受体共同注射可使脑梗死体积增大和浸润的淋巴细胞数量增多。本研究主要关注脑梗死急性期IL-6中和抗体处理抑制脑组织急性期炎性反应的作用。

不同时相的IL-6表达对神经组织产生不同的作用，损伤前IL-6的正常表达或高水平表达可对神经损伤产生保护作用，但在神经损伤发生后再增加IL-6的表达，会加重神经损伤。本研究针对缺血性脑卒中后升高的IL-6予以中和抗体处理，减轻炎性反应。目前针对缺血性脑卒中急性期炎性反应的治疗方法众多，已有2期临床试验静脉给予缺血性脑卒中患者IL-1受体拮抗剂（IL-1R）治疗急性期炎性反应，可降低皮质醇水平，逆转脑卒中急性期的免疫抑制状态［13］。在动物模型中预先给予选择性TNF-α抑制剂（3，6’-二硫代沙利度胺）可缩小脑梗死体积，减少神经元凋亡，改善神经功能。IL-6中和抗体治疗也可减轻小鼠心脏移植急性排斥反应和保护急性免疫性心肌炎等。

缺血性脑卒中后的炎性反应进程中存在多种促炎细胞因子，如TNF-α、IL-1和IL-6。外周血、脑脊液和损伤处脑组织均可检测到促炎细胞因子表达升高。IL-6等促炎细胞因子加重脑组织损伤的机制为多方面的，如诱导选择素E、细胞间黏附因子1（ICAM-1）、血管细胞黏附因子（VCAM-1）表达，这些位于内皮细胞上的黏附因子与淋巴细胞表面的整合素结合，参与T淋巴细胞浸润至中枢神经系统的过程；同时激活的淋巴细胞释放神经毒性因子、蛋白水解酶，诱导内皮细胞释放血小板激活因子、凝血因子Ⅷ等多种组织因子，促进凝血过程和血栓发生；聚集于脑血管中的淋巴细胞影响脑血流，前述过程均加重局部脑缺血损伤［11，14］。

本研究结果表明，IL-6中和抗体处理能明显缩小小鼠脑缺血后的脑梗死体积，抑制急性炎性细胞对脑组织的浸润，从而改善脑梗死后28 d的长期神经功能预后，提示IL-6中和抗体处理可能作为治疗脑缺血损伤的有效方法。

综上所述，缺血性脑卒中模型中IL-6中和抗体早期处理可能通过抑制急性期炎性反应以缩小脑梗死体积和改善感觉运动功能。通过IL-6中和抗体调节脑卒中后机体的炎性反应，为临床治疗策略和新药研发转化提供了新的思路。