肿瘤易化小鼠术后认知功能障碍的发生

吴 彤 汪晓强 张芮芮 苏殿三 俞卫锋 田 婕

术后认知功能障碍（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是一种常见的麻醉手术相关的并发症，可发生于14%～24%的非心脏手术患者，其特点是患者手术后认知学习行为能力受损，对外界信息的处理能力降低［1-2］，可严重影响患者的术后生活质量，甚至发展为不可逆的认知障碍［3］。关于POCD的发病机制尚不完全清楚，目前最为广泛接受的假说是中枢炎性反应是POCD的关键致病原因［4-6］。目前，全球由肿瘤所致的负担逐年加重，随着临床诊断技术的发展、外科手术技术的进步和治疗手段的不断革新，约80%的肿瘤患者需要手术干预［7-8］。随着人口老龄化的发展，肿瘤患者的术后精神健康状态不仅是一个重要的临床议题，毫无疑问也将成为一个不可忽视的社会问题［9-10］。值得注意的是，肿瘤与炎性反应的关系十分复杂。一方面，慢性炎性反应在肿瘤的发生中扮演着重要角色，至少25%的肿瘤发生与慢性炎性反应相关［11-12］；另一方面，各种各样的炎性细胞，包括先天性免疫和获得性免疫细胞，都可以被肿瘤细胞激活［13-14］。在机体识别到肿瘤细胞的存在时，绝大多数炎性细胞都会扩增、分泌炎性细胞因子或在肿瘤微环境中与其他细胞产生交互作用而影响肿瘤的进程［13-16］。由激活免疫系统引起的神经炎症的瀑布反应是认知损伤的关键因素，因此推测拥有特殊炎症环境的荷瘤个体在受到手术应激时会表现出与正常个体不同的免疫防御特点和神经炎症应答，因而其术后认知功能与正常个体可能也有所不同。本研究通过结合小鼠皮下荷瘤模型与骨科手术，探讨荷瘤状态对小鼠术后认知功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物的构建和分组 本研究的伦理审查证明由上海交通大学医学院附属仁济医院实验动物饲养管理中心提供（RJ-2017-10-10）。2月龄雄性C57BL／6J小鼠由上海交通大学医学院实验动物研究中心提供，体重23～25 g。将小鼠饲养于标准化笼盒内自由饮食，维持温度为（22±2）℃，环境为每12 h日夜交替。小鼠适应新的环境至少长于实验开始前的7 d。根据荷瘤和手术情况，将小鼠随机分入对照组、手术组、肿瘤组和肿瘤加手术组。

1.2 肿瘤接种模型建立 肿瘤组和肿瘤加手术组小鼠于右背侧腋窝皮下组织内接种小鼠来源的结肠癌细胞系 MC38细胞悬液（100μL），接种细胞数量为2×105／只。随后，小鼠被放回各自的笼盒中，接种后第7天起，每2～3 d检查一次小鼠的基本状况。3周后，待肿瘤长径为0.8～1.0 cm，行胫骨骨折内固定手术。

1.3 胫骨骨折内固定术 手术组和肿瘤加手术组小鼠在氟哌利多（200μg／kg）和芬太尼（10 mg／kg）复合麻醉下行胫骨骨折内固定手术。切皮前于皮下注射布托啡诺（0.4 mg／kg）镇痛。左后侧胫前皮肤备皮、消毒、铺巾，于左后侧胫前皮肤沿中线做一长约1 cm的纵形切口，分离并暴露小鼠胫骨，分离骨膜。将一根长约8 mm、直径0.38 mm的针置入骨髓腔内，切断胫骨。术毕，用0.9%氯化钠溶液清理伤口，缝合切口，将小鼠放回干净的笼盒内，保温，等待麻醉苏醒。

1.4 Morris水迷宫实验 每组取7或8只小鼠，采用用Morris水迷宫实验检测各组小鼠的参考记忆（reference memory）。在水迷宫开始前，每天抚触小鼠约2 min，持续3 d，让小鼠熟悉实验者的气味，以减少应激反应。在胫骨骨折手术后第3天开始水迷宫实验，实验持续5 d，分为定位航行实验和空间探索实验。定位航行实验历时4 d，每天训练4次，每轮间隔30～40 min，将平台置于第2象限（靶象限）中间位置，距水面1～2 cm，训练过程中平台位置保持不变，每天随机选取除靶象限外的其他3个象限的任意4个定点投放小鼠。小鼠入水后可自由寻找平台，若在1 min内成功找到平台，该轮训练终止，并使小鼠在平台上停留20 s；若小鼠不能在1 min内成功找到平台，可将其轻轻引导至平台并使其在平台上停留20 s，记录小鼠游泳的轨迹、运动速度和找到水下平台所用时间（逃避潜伏期）。水迷宫实验第5天，进行空间探索实验检测小鼠对空间位置的记忆能力。撤掉平台，分别在目标象限和相反象限入水点将小鼠投入池内，记录小鼠60 s内各象限时间分布和游泳速度等参数，两次实验结果取平均值。具体方法参照参考文献［17］。

1.5 Western印迹法检测小鼠海马组织内可溶性淀粉样前体蛋白（s APP）α和IL-6蛋白质表达分别于胫骨骨折内固定术后第7天和术后48 h处死小鼠并分离其海马组织，提取蛋白质，检测s APPα和IL-6蛋白质表达。采用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量（美国Thermo Fisher公司）法定量蛋白质浓度，以总蛋白质量25μg／孔进行8%SDS-PAGE变性电泳。电泳结束后，将凝胶上的蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。以3%胎牛血清白蛋白（BSA）于室温封闭1 h。所用一抗分别为小鼠抗小鼠s APPα抗体（1∶1 000，德国IBL公司），兔抗小鼠IL-6抗体（1∶1 000，美国CST公司），二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（比例均为1∶1 000，上海碧云天生物技术有限公司），以β-actin为内参照。显色条带后，应用Image Lab图像分析软件分析处理条带。

1.6 RT-PCR检测小鼠海马组织内IL-6 mRNA表达 每组另取8只小鼠，术后48 h取1叶海马组织放入TRIzol（美国Sigma公司）中提取RNA。然后将RNA样本溶解于DEPC溶液中，应用Nano drop分光光度计检测提取的mRNA浓度。应用反转录试剂盒（日本Ta KaRa公司）将m RNA转化为cDNA，将荧光染料SYBR Green与cDNA配成10μL反应体系，进行RT-PCR扩增。IL-6上游引物为5’-TAG TCC TTC CTA CCC CAA TTT CC-3’，下 游 引 物 为 5’-TTG GTC CTT AGC CAC TCC TTC-3’；GAPDH 上游引物为5’-AAG AAG GTG GTG AAG CAG GCA TC-3’，下游引物为5’-CGG CAT CGA AGG TGG AAG AGT G-3’。

1.7 ELISA检测小鼠外周血血浆中IL-6含量每组另取的8只小鼠术后48 h取海马组织的同时取其外周血。离心分离血浆后，参照IL-6 ELISA试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司）说明书进行操作。所有步骤完成后，应用酶标仪检测波长为450和570 nm吸光度A值，用A570值矫正检测结果。根据标准曲线计算各样本IL-6含量。

1.8 统计学处理 应用Prism 7统计学软件。呈正态分布的计量资料以x-±s表示，采用连续测量的方差分析比较小鼠Morris水迷宫平均游泳速度和小鼠逃避潜伏期随训练天数的变化情况；采用单因素方差分析比较各组小鼠测试阶段的穿越平台次数、目标象限游泳时间、海马组织中IL-6和s APPα蛋白质表达水平、IL-6 m RNA表达水平，以及血浆IL-6含量。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况 MC38肿瘤细胞接种2周后，小鼠皮下可触及瘤体组织。再1周后，肿瘤长径达到0.8～1.0 cm，对小鼠左后肢行胫骨骨折内固定术。与对照组小鼠相比，肿瘤组和肿瘤加手术组小鼠进食饮水和自主行为无明显异常，皮毛有光泽。

2.2 Morris水迷宫实验结果 各组小鼠间游泳速度的差异无统计学意义（P值均＞0.05）；水迷宫实验第3和4天定位航行实验阶段，肿瘤加手术组小鼠的逃避潜伏期显著长于对照组同时间（P值分别＜0.05、0.01），而手术组和肿瘤组与对照组间的差异均无统计学意义（P值均＞0.05），见表1。水迷宫实验第5天空间探索实验阶段，撤掉水下平台后，肿瘤加手术组小鼠在目标象限游泳时间显著短于对照组（P＜0.05），穿越平台所在位置的次数显著少于对照组（P＜0.01），而手术组和肿瘤组与对照组间的差异均无统计学意义（P值均＞0.05），见表2。

2.3 术后小鼠海马组织内s APPα表达 对照组、手术组、肿瘤组和肿瘤加手术组小鼠海马组织内sAPPα的相对蛋白质含量分别为0.28±0.05、0.23±0.05、0.24±0.09、0.16±0.03，肿瘤加手术组显著低于对照组（P＜0.05），而手术组和肿瘤组与对照组间的差异均无统计学意义（P值均＜0.05），见图1。（x-±s）

表1 4组小鼠Morris水迷宫游泳速度和逃避潜伏期比较

表2 4组小鼠空间探索实验目标象限游泳时间和穿越平台所在位置次数比较（x-±s）

图1 Western印迹法检测各组小鼠海马组织内s APPα蛋白质的表达

2.4 术后小鼠海马组织内IL-6蛋白质和IL-6 mRNA表达 对照组、手术组、肿瘤组和肿瘤加手术组小鼠海马组织内IL-6蛋白质相对表达量分别为1.04±0.12、1.35±0.21、1.17±0.17、1.94±0.62，肿瘤加手术组显著高于对照组（P＜0.01），而手术组和肿瘤组与对照组间的差异均无统计学意义（P值均＞0.05），见图2。对照组、手术组、肿瘤组和肿瘤加手术组小鼠海马组织内IL-6 m RNA相对表达量分别为1.07±0.41、1.25±0.31、1.25±0.33、1.12±0.43，各组间的差异均无统计学意义（P值均＞0.05）。

图2 Western印迹法检测各组小鼠海马组织内IL-6蛋白质表达

2.5 术后小鼠外周血血浆内IL-6水平 术后48 h对照组、手术组、肿瘤组和肿瘤加手术组小鼠血浆IL-6水平分别为（0.97±0.26）、（3.47±1.27）、（4.56±2.34）、（9.16±6.65）ng／L，肿瘤加手术组显著高于对照组（P＜0.05），而手术组和肿瘤组与对照组间的差异均无统计学意义（P值均＞0.05）。

3 讨 论

本研究通过建立成年小鼠皮下荷瘤和胫骨骨折内固定手术模型，检测荷瘤状态对小鼠POCD的影响。本研究发现，胫骨骨折内固定手术不影响普通成年小鼠术后空间参考记忆，但会引起成年荷瘤小鼠该种记忆的损伤，伴随脑内神经营养分子s APPα表达降低，以及术后48 h外周血血浆和海马组织中促炎细胞因子IL-6表达水平升高，但是海马组织中IL-6 mRNA相对表达量无明显变化。大量文献提示，中枢高水平IL-6与机体学习记忆能力降低密切相关，本研究结果提示，荷瘤小鼠更容易发生POCD可能与其手术后海马组织中高表达IL-6有关，而IL-6更可能来源于外周而非中枢本身。

本研究应用Morris水迷宫检测小鼠能否对水下平台的空间位置形成准确记忆。在定位航行实验阶段，各组小鼠的逃避潜伏期随训练天数的增加逐渐缩短，表明各组小鼠逐渐对水下平台位置形成记忆。空间探索实验结果提示，肿瘤加手术组小鼠在目标象限的平均游泳时间显著短于对照组，穿过原水下平台位置的次数显著少于对照组，表明该组小鼠的记忆能力显著低于对照组小鼠。这一现象未在手术组小鼠中出现，提示与普通小鼠相比，荷瘤小鼠更容易在术后出现认知功能损伤。空间参考记忆代表了小鼠对水下平台的长时记忆能力，其管理中枢主要位于海马组织，因此之后本研究检测了海马组织中s APPα表达。s APPα是淀粉样前体蛋白（APP）在内切酶的作用下生成的子片段，与同样是在APP剪切后形成的Aβ不同，s APPα具有较为公认的神经营养和保护作用，可增加突触密度，促进已有的记忆巩固，防止毒性物质对神经突触的损伤［18-19］。本研究结果显示，术后荷瘤小鼠海马组织内s APPα的相对蛋白质含量显著低于对照组，证明手术可引起荷瘤小鼠海马组织内具有神经保护作用的分子表达降低，使得肿瘤加手术组小鼠自身的神经保护作用低于一般小鼠。

既往研究［4-5，20］结果提示，外周手术可引起成年个体发生一过性中枢炎性反应。术后12 h海马区IL-6水平升至峰值［4，21］，术后48 h降至基础水平［22］，这种一过性中枢炎性反应不会损伤成年小鼠的空间参考记忆［20］。本研究结果也显示，普通成年小鼠海马组织内IL-6蛋白质相对表达量在术后48 h基本回归基础水平，而荷瘤小鼠海马组织内的IL-6表达仍保持在较高水平。由于广泛而长时的中枢炎性细胞因子暴露是导致认知紊乱的关键因素［21-23］，因而术后荷瘤小鼠海马组织内的IL-6持续高表达为荷瘤小鼠更容易发生POCD提供了合理的解释。有趣的是，在MC38肿瘤模型中，荷瘤小鼠术后48 h海马组织内IL-6 mRNA相对表达量在各组间的差异无统计学意义，且在血浆中IL-6水平的升高趋势与海马组织中IL-6蛋白质相对表达量的升高趋势保持一致，据此推测，术后48 h荷瘤小鼠海马组织内升高的IL-6更可能来源于外周循环中活化的炎性细胞，而不是海马组织本身。荷瘤小鼠手术后外周循环中炎性细胞因子长时间高表达的原因尚不清楚，推测可能与荷瘤个体中的肿瘤相关免疫细胞在手术后活化有关，尚需要更多的研究加以证实。

本研究存在一定局限性。尽管本研究结果初步显示持续的荷瘤状态可易化POCD发生，且这一现象可能与荷瘤小鼠手术后体循环中高表达的IL-6有关，但并未对IL-6进行干预以证实其与POCD的真正相关性，也未能找到其准确的细胞来源，有待今后就上述问题进一步研究。

综上所述，本研究证明了与普通小鼠相比，荷瘤小鼠更容易发生POCD，伴随海马组织中神经营养分子s APPα表达降低，其原因可能与荷瘤状态加重手术导致的外周免疫反应和促进中枢炎性反应有关。对该领域的进一步研究将促进对POCD的理解，并有助于改善肿瘤患者的术后精神状态。