HPLC测定亚麻籽油苦味肽的纯化富集前处理研究

李田楠，黄健花，刘睿杰，常 明，王小三，王兴国，金青哲

(江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122)

随着现代人对养生的关注，亚麻籽油因具有多种保健功能日渐得到消费者的青睐[1]。然而，亚麻籽油在储存中常易氧化变苦[2]，Brühl等[3]鉴定证实亚麻籽油的关键苦味化合物为一种环八肽(Cyclolinopeptide E，CLE)，俗称苦味肽。

目前，关于亚麻籽油CLE的定量检测多采用HPLC法，以往关于CLE定量的研究中多侧重CLE在亚麻籽油加工或储存过程中的变化[4-6]，几乎未有文献关注不同前处理方法对CLE测定效果的影响，仅利嘉祥等[7]对SPE硅胶柱分离法与乙醇萃取法做了比较，认为乙醇萃取法对于亚麻籽油中环肽的富集更有优势。

对于油脂样品中微量伴随物测定的前处理方法主要有溶剂萃取法和固相萃取法(SPE)。溶剂萃取法是一种经典的色谱分析前处理方法，具有设备简单、成本低等优点，但也存在萃取时间长、液态样品易乳化等问题。固相萃取法采用高选择性的固定相，改善了因溶剂萃取过程中的乳化现象对样品定量造成的偏差[8-9]，然而Sharav等[10]采用硅胶柱层析提取亚麻籽油环肽，分析前需要装柱，操作人员的影响较大，且上样量和试剂消耗量大。目前市场上可买到商品化的固相萃取小柱，操作简单、所需样品和溶剂量少，成为一种常用的样品前处理方法。

本文对高效液相色谱定量测定亚麻籽油苦味肽的溶剂萃取法和固相萃取法纯化富集前处理效果进行了比较，旨在为亚麻籽油苦味肽选择合适的纯化富集前处理方法，为深入研究亚麻籽油的苦味奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

亚麻籽油，由宁夏君星坊食品科技有限公司提供。

SPE硅胶小柱，上海安谱公司；Cyclolinopeptide E标准品，纯度99%，加拿大Prairie Tide化学品公司；无水甲醇、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、无水乙醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；乙腈、甲醇，色谱纯，百灵威科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

Waters Acquity型超高效液相色谱仪，Waters Synapt Q-TOF-MS质谱仪，Masslynx 4.1色谱工作站；Waters1525高效液相色谱仪，Waters 2996可变波长二极管阵列检测器；KH7200DB型数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；R-501旋转蒸发器，上海申顺生物科技有限公司；SHZ-3循环水多用真空泵；AL204电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 溶剂萃取法提取亚麻籽油中苦味肽

1.2.1.1 甲醇溶剂萃取法

参考Aladedunye等[6]的环肽提取方法。称取1 g 亚麻籽油加入10 mL色谱纯甲醇，旋涡振荡1 min，超声处理1 h，离心后收集上清液。

1.2.1.2 乙醇溶剂萃取法

参考利嘉祥等[7]的方法。称取5 g亚麻籽油，以料液比5∶8加入无水乙醇，旋涡振荡5 min。离心后吸取上清液，重复萃取3次，合并萃取液，40℃旋蒸脱溶，用色谱级甲醇将烧瓶底部的油移至离心管中，旋涡振荡并离心，吸取上清液至10 mL的容量瓶中，定容。

1.2.2 固相萃取法提取亚麻籽油中苦味肽

比较填料为0.5、1、2 g不同规格SPE硅胶小柱的前处理效果，参考Gui等[11]的样品前处理方法。先分别将硅胶柱用1、2、4 mL正己烷活化，将1 g油样溶于1 mL正己烷，上柱。在真空条件下，依次用正己烷、正己烷-乙酸乙酯(体积比8∶2)、正己烷-乙酸乙酯(体积比5∶5)各10 mL进行洗脱，将小柱抽干后，再分别用乙酸乙酯、甲醇-二氯甲烷(体积比1∶9)各10 mL进行洗脱，收集最后两步洗脱液，合并后于40℃旋蒸脱溶，用色谱级甲醇分2～3次复溶圆底烧瓶底部的环肽，并通过超声促进溶解，定容至5 mL。

1.2.3 HPLC定量测定亚麻籽油苦味肽

将亚麻籽油样品按照1.2.1或1.2.2方法前处理后，经过HPLC进行定量分析，采用外标法定量。

参考连莹君等[12]梯度洗脱的方法，使用Amethyst C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈为流动相A、超纯水为流动相B，紫外检测波长214 nm，柱温35℃，进样量20 μL条件下测定。苦味肽含量按下式计算。

式中：x为亚麻籽油中苦味肽含量，mg/kg；ρ为试样测定液中苦味肽质量浓度，μg/mL；V为试样测定液定容体积，mL；m为试样的称样量，g。

2 结果与讨论

2.1 溶剂萃取法与固相萃取法比较

2.1.1 溶剂萃取法与固相萃取法的除杂效果比较

取一苦味亚麻籽油为试验原料，分别用溶剂萃取法和固相萃取法进行前处理，通过HPLC测定CLE含量。所有前处理方法测得的HPLC谱图显示，通过溶剂萃取法和固相萃取法前处理，CLE均可以得到良好的分离效果，所测CLE在色谱图中均于保留时间19 min左右出峰，前处理不影响CLE的出峰。但是，就不同前处理方法油样的各色谱图的杂峰而言，与SPE硅胶小柱前处理相比，溶剂萃取前处理后油样的色谱图中保留时间在28 min以后有较多杂峰，其中含有较多的甘油三酯，这些杂质的存在对于保护液相色谱柱、提高柱效是极为不利的。溶剂萃取预处理亚麻籽油的HPLC谱图之所以有大量杂峰，是由于油脂在萃取溶剂中存在一定程度的溶解，尤其是乙醇萃取法样品，由于其对油脂溶解性相对更好[13]，杂峰尤为明显，即使以油脂溶解性较差的甲醇为例，甲醇萃取法预处理油样的HPLC谱图中，所含杂质的峰面积是CLE峰面积的7.14倍，而SPE硅胶小柱前处理油样将甘油三酯及其他杂质有效去除，其色谱图所含杂质的峰面积是CLE峰面积的4.23倍(甲醇萃取预处理和SPE预处理亚麻籽油HPLC谱图见图1，其余色谱图略)。因此，为了保护色谱柱、提高柱效、延长柱子使用寿命，固相萃取法预处理较溶剂萃取更理想。

注：a.甲醇萃取预处理；b.SPE预处理。

2.1.2 溶剂萃取法与固相萃取法的提取效果比较

不同方法预处理的除杂效果存在较大差异，但是就分析检测方法的样品前处理而言，仅仅实现有效除杂是不够的，脱除杂质的同时，还须实现待测物的有效保留，因此进一步比较了同一亚麻籽油样品经不同前处理后，所测得的CLE含量，评估不同前处理方法对亚麻籽油CLE测定的有效性，结果如表1所示。

表1 不同前处理方法提取同一亚麻籽油CLE测定结果

注：同列不同字母表示具有显著性差异(p<0.05)。

由表1可知，乙醇溶剂萃取法对亚麻籽油进行前处理所测CLE含量比其他方法明显偏低，甲醇溶剂萃取与固相萃取法前处理所测CLE含量基本相当。进一步对比3种不同规格的SPE硅胶小柱的前处理效果，发现随着SPE硅胶小柱填料量的增加，CLE含量测定值减小，使用填料规格为0.5 g的SPE硅胶小柱对亚麻籽油进行前处理所测CLE含量最高。

综上所述，采用填料为0.5 g的SPE硅胶小柱进行亚麻籽油CLE测定的前处理，较溶剂萃取法具有更好的除杂与提取效果，该SPE硅胶小柱前处理方法更适宜进行亚麻籽油CLE测定前的纯化富集。

2.2 固相萃取法前处理方法的评价

2.2.1 苦味肽的定性分析

为了进一步评估固相萃取法作为亚麻籽油中CLE提取方法的有效性，将亚麻籽油样品经过填料规格为0.5 g的SPE硅胶小柱处理后送样检测，与CLE标准品同时通过超高效液相色谱-质谱联用仪进行定性分析。CLE在正离子模式下易形成[M+H]+等准分子离子，首先根据m/z为977.5选出目标峰，通过分析其二级质谱(见图2)，判断是否为CLE分子。

图2 CLE标准品(a)与亚麻籽油样品m/z为

由图2可知，CLE标准品的二级质谱图中主要峰的m/z分别为977.50、913.48、830.46、731.39、618.31、554.30、408.18、358.19、261.12、211.13、183.14、120.07。而在亚麻籽油样品m/z为977.5的化合物的二级质谱图中，以上m/z均能找到，因此可证明该化合物是CLE。这说明固相萃取法可以将亚麻籽油中存在的CLE有效提取出来。

2.2.2 准确度评价和精密度评价

取两份质量为1.0 g的亚麻籽油，在其中一份中加入1 mL 100 μg/mL的CLE标准甲醇溶液，与另一份同时经过填料规格为0.5 g的SPE硅胶小柱前处理后，测定CLE含量，计算样品加标回收率，结果见表2。

表2 苦味肽的样品加标回收率

由表2可知，样品加标回收率测定结果与GB/T 27404—2008中的参考范围非常接近。

将亚麻籽油经过填料规格为0.5 g的SPE硅胶小柱前处理，分别于4、8、12 h测定CLE含量，计算得到组内精密度相对标准偏差为0.62%；将前处理后的样品连续测定5 d，计算得到组间精密度的相对标准偏差为1.79%。综上，说明该方法的准确度和精密度良好。

3 结 论

本文比较了HPLC定量测定亚麻籽油苦味肽的溶剂萃取法和固相萃取法的纯化富集前处理效果。就除杂效果而言，固相萃取法比溶剂萃取法所提取的环肽样品中甘油三酯及其他杂质显著减少，有利于保护液相色谱柱、提高柱效；就提取效果而言，使用填料规格为0.5 g的SPE硅胶小柱可以得到较好的分离及富集效果。经过定性分析、准确度及精密度评价，证明此方法准确可靠，可作为测定亚麻籽油中苦味肽含量的前处理方法。