高顺式占比番茄红素纳米结构脂质载体的制备及贮藏稳定性研究

熊文慧，姜 欣，孙清瑞，张 建，张连富,

(1.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122； 2.国家功能食品工程技术研究中心，江苏 无锡 214122； 3.黑龙江八一农垦大学 食品学院，黑龙江 大庆 163319; 4.石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832003)

番茄红素是一种天然的具有生理活性的类胡萝卜素，有较强的抗氧化性，具有降低癌症和动脉粥样硬化发病风险、抑制前列腺良性增生等多种生理功能[1-2]。从结构上看，番茄红素是一种共轭烯烃，分子中含有11个碳碳共轭双键和2个非共轭双键[3-4]，存在大量的同分异构体。研究表明，顺式构型的番茄红素比天然存在的全反式番茄红素更容易被人体吸收，吸收效率达到(4～5)∶1[5]。

番茄红素的疏水结构使其在食品应用中受到限制，构建油水稳定体系对改善番茄红素在水基食品中的应用非常关键。现有的番茄红素水分散性改造方法包括微乳技术[6]、固体脂质纳米技术(SLN)[7]、纳米结构脂质载体(NLC)技术[8]等。相比较而言，NLC技术作为一种新型脂质包埋纳米技术比较适合用于改善番茄红素的水分散性。孙清瑞[5]、刘会晓[9]等研究建立了以单硬脂酸甘油酯和中链甘油三酯为固液脂，Tween80为乳化剂的番茄红素纳米结构脂质载体稳定体系，成功解决了较高载量(4%)的番茄红素纳米结构脂质载体的稳定性问题，由于其选用Tween80作为乳化剂，产品风味欠佳，消费者接受程度受到影响。

针对上述问题，本文尝试筛选酪蛋白酸钠、乳清分离蛋白、Quillaja saponin(Q-Naturale)等天然乳化剂作为Tween80的替代，同时从改善产品生理功能角度，尝试以高顺式占比番茄红素作为包埋对象，优选富含ω-3多不饱和脂肪酸的功能性油脂作为NLC体系的液态脂，制备口味更佳、功能性更强的高顺式占比番茄红素的NLC稳定体系，为类胡萝卜素等功能性色素的应用提供思路和方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

番茄红素标准品(纯度≥98%)，华北制药厂；番茄红素(顺式构型占比为69.82%)，国家功能食品工程技术研究中心番茄红素课题组提供；硬脂酸甘油酯(GMS，熔点56～58℃)、棕榈酸甘油酯(熔点63℃)、山嵛酸甘油酯(熔点65～77℃)、Tween80，国药集团化学试剂有限公司；牛油(熔点40～46℃)、牡丹籽油、亚麻籽油、紫苏籽油、藻油，市售；酪蛋白酸钠(CA)、乳清分离蛋白(WPI)，无锡盛世宏程生物科技有限公司；Quillaja saponin(Q-Naturale)，宜瑞安食品配料有限公司；其他试剂均为分析纯。

Zetasizer Nano-ZS90型激光粒度仪，英国Malvern公司；高效液相色谱仪，北京创新通恒科技有限公司；AH 2010 高压均质机，ATS 工业系统有限公司(上海)； 高速剪切机，德国IKA 公司；电子分析天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；EBA20/20S离心机，德国Hettich公司；UV-2802型紫外可见光分光光度计，尤尼柯(上海) 科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 高顺式占比番茄红素纳米结构脂质载体(cis-Lyco-NLC)的制备

采用熔融-预乳化和高压均质联用法[9]。称取高顺式占比番茄红素(cis-Lyco)0.3 g，总脂质(固态脂与液态脂质量比3∶1)7.5 g，于85℃加热形成均一的油相，将100 mL质量浓度为3 g/100 mL的乳化剂溶液加热至75℃后与油相混合，并在300 r/min下搅拌1 min，随后将混合液经高速剪切(16 000 r/min)形成预乳液，预乳液经高压均质(100 MPa，3 循环)后快速冷却至室温，得到cis-Lyco-NLC，于冰箱(4℃)保存待分析。

1.2.2cis-Lyco-NLC中番茄红素总量的测定

称取番茄红素标准品2.5 mg，用一定量乙酸乙酯完全溶解后定容于50 mL棕色容量瓶中，得到50 μg/mL的标准母液。分别移取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL标准母液定容到10 mL棕色容量瓶中，得到质量浓度梯度为2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 μg/mL的系列标准溶液。采用高效液相色谱(HPLC)分析，利用峰面积归一化法确定番茄红素及其异构体的含量。以番茄红素质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得到番茄红素的标准曲线方程为y=108 848x-72 073(R2=0.999 9)。其中HPLC分析条件为：YMC carotenoid 色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；等度洗脱，流速1.0mL/min；流动相V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(甲基叔丁基醚)为27∶23∶50；柱温25℃；检测波长471 nm；进样量20 μL。

移取100 μLcis-Lyco-NLC样品，用等体积的无水乙醇破乳后，用乙酸乙酯定容于10 mL棕色容量瓶中，按照上述HPLC分析条件对样品进行检测，再通过番茄红素的标准曲线方程计算样品中番茄红素的总量。

1.2.3cis-Lyco-NLC包封率和载量的测定

采用有机溶剂萃取法测定游离番茄红素含量。移取一定量cis-Lyco-NLC样品，加入3 mL正己烷，旋涡振荡30 s后，在3 000 r/min的条件下离心60 s，收集上清液，沉淀再次加入3 mL正己烷，进行上述重复操作3次，合并上清液，定容于10 mL棕色容量瓶中，在471 nm处测定吸光度。以正己烷溶解的番茄红素标准品的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到番茄红素标准曲线方程为y=0.200 3x-0.004(R2=0.999 5)。对照标准曲线方程计算样品中游离番茄红素含量。按下式计算cis-Lyco-NLC样品的包封率和载量。

包封率=(番茄红素总量-游离番茄红素量)/番茄红素总量×100%

载量=番茄红素总量/总脂质含量×100%

1.2.4cis-Lyco-NLC样品平均粒径和电位的测定

移取cis-Lyco-NLC样品10 μL，用10 mmol/L pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液稀释至10 mL以防止多重散射的影响。将稀释后的样品放入电位池中，采用Zetasizer Nano-ZS90型激光粒度仪测定样品的电位；随后将样品放入聚苯乙烯比色皿(折光指数1.33)中，采用配有He/Ne激光器(λ=633 nm)的Nano-ZS90型激光粒度仪，在散射角173°、温度25℃的条件下测定样品的平均粒径。通过样品在45℃下贮藏10 d平均粒径和电位的变化分析样品的物理稳定性。

1.2.5cis-Lyco-NLC样品化学稳定性的测定

已有研究表明，样品中类胡萝卜素的降解与颜色变化之间有良好的相关性[10]。本文利用色差计测定cis-Lyco-NLC样品在45℃下贮藏10 d的颜色变化来比较样品的化学稳定性。在室温条件下将10 mLcis-Lyco-NLC移到培养皿中进行颜色测定。

色差计根据CIE颜色体系测定样品的颜色坐标L*值、a*值、b*值。其中L*值表示颜色的亮度(黑色L*值为0，白色L*值为100)，a*表示红绿差异(a*值越大，红色越深)，b*表示黄蓝差异(b*值越大，黄色越深)。使用下式计算总颜色的变化ΔE。

1.2.6cis-Lyco-NLC样品贮藏稳定性的测定

分别将cis-Lyco-NLC样品注满并密封保存于30 mL的棕色样品瓶中，随后置于-18、4、25、45℃的条件下避光贮藏35 d，测定样品中番茄红素保留率及平均粒径的变化。番茄红素保留率按下式计算。

保留率=产品贮藏一段时间后番茄红素含量/产品初期番茄红素含量×100%

2 结果与分析

2.1 cis-Lyco-NLC中固液脂的筛选

采用不同熔点的固态脂(牛油、GMS、棕榈酸甘油酯、山嵛酸甘油酯)，分别与富含ω-3多不饱和脂肪酸的功能性油脂(藻油、紫苏籽油、亚麻籽油、牡丹籽油)组合构成固液脂，利用Tween80作为乳化剂制备cis-Lyco-NLC样品，测定包封率、载量、平均粒径，同时观察制备的cis-Lyco-NLC样品中番茄红素在液面的漂浮程度以筛选合适的固液脂组合，结果见表1。

表1 不同固液脂组合制备cis-Lyco-NLC样品的情况

注：番茄红素的漂浮程度是指放置在样品瓶中样品表面番茄红素的漂浮情况，*表示番茄红素的漂浮程度，*越多，样品表面番茄红素漂浮的量越多。

由表1可知，固态脂的种类对cis-Lyco-NLC样品的平均粒径、包封率、载量影响较大，而液态脂只有藻油对样品的影响较大。这可能是因为藻油中含有丰富的长链不饱和脂肪酸，二十二碳六烯酸(DHA)含量较高[11]，而亚麻籽油、紫苏籽油、牡丹籽油中的不饱和脂肪酸主要是α-亚麻酸，化学组成相近[12-13]。在使用熔融-预乳化方法制备cis-Lyco-NLC时，液态脂的熔融效果相同，固态脂由于熔点和物理性质的不同使得制备的cis-Lyco-NLC样品之间存在较大差异。GMS和牡丹籽油作为固液脂组合制备的cis-Lyco-NLC样品包封率高达92.10%，载量为3.68%，且表面无明显的番茄红素漂浮，样品平均粒径为212.61 nm，有利于维持样品稳定。因此，选择的最佳固液脂组合为GMS和牡丹籽油。

2.2 cis-Lyco-NLC中乳化剂的筛选

选定GMS和牡丹籽油为最适固液脂组合，Tween80、CA、Q-Naturale、WPI作为乳化剂，按照1.2.1的方法制备cis-Lyco-NLC样品，考察乳化剂对cis-Lyco-NLC样品物理化学稳定性的影响，筛选最适的乳化剂。

2.2.1 不同种类乳化剂对cis-Lyco-NLC样品贮藏期间物理稳定性的影响

图1为不同种类乳化剂制备的cis-Lyco-NLC样品在贮藏过程中平均粒径的变化情况。

图1 乳化剂种类对cis-Lyco-NLC平均粒径的影响

由图1可见，乳化剂对cis-Lyco-NLC样品的平均粒径有很大的影响，不同种类乳化剂制备的cis-Lyco-NLC样品在贮藏初期平均粒径都相对较小(<500 nm)，有利于防止液滴聚集和维持样品稳定。贮藏过程中由Q-Naturale作为乳化剂制备的cis-Lyco-NLC样品平均粒径明显增加，表明样品发生了某种形式的液滴聚集，如絮凝或聚结。这可能是在均质过程中没有足够的Q-Naturale覆盖液滴表面，造成样品中液滴的絮凝和合并[14]。WPI作为乳化剂制备的cis-Lyco-NLC样品平均粒径在贮藏前期维持不变，贮藏后期略有增加，这可能是随着贮藏时间的延长，液滴发生了部分絮凝导致平均粒径增大。在贮藏期间Tween80制备的样品平均粒径先增加后减少，可能是经过较长时间的贮藏后在样品顶部形成单独的油相而与体系分离，最终仅在原样品中保持较小的液滴，从而导致平均粒径明显减小[15]。CA作为乳化剂制备的cis-Lyco-NLC样品由于液滴间的空间排斥作用在贮藏期间平均粒径基本维持不变，乳液稳定性好[16]。

图2为不同种类乳化剂制备的cis-Lyco-NLC样品在贮藏过程中电位的变化情况。

图2 乳化剂种类对cis-Lyco-NLC电位的影响

由图2可见，不同种类乳化剂制备的cis-Lyco-NLC样品在贮藏初期电位特征明显不同，由Q-Naturale、WPI、CA制备的样品有很高的电负性，电位在-35 mV左右，而由Tween80制备的样品电位为-16 mV。WPI、CA等蛋白制备的cis-Lyco-NLC样品具备高电负性是因为样品的pH高于蛋白质的等电点(PI约为5.6)，表面存在额外的羧基使得样品带有较高的负电位[17]。而由Q-Naturale制备的cis-Lyco-NLC样品因其在中性条件下存在带电荷的羧基而呈高电负性[14]。Tween80作为一种非离子表面活性剂，几乎不带电，但是已有研究表明Tween80在中性条件下会因为吸附水中的氢氧根离子而带适当的电负性，或者由于牡丹籽油中的杂质(如游离脂肪酸)等阴离子的存在，使其可能在中性条件下具有明显的负电荷，带适当的电负性[15]。不同种类乳化剂制备的样品在贮藏9 d后电位大小都有一些变化，这表明贮藏过程中界面组成可能有一些变化。贮藏期间测定不同种类乳化剂制备样品的平均粒径和电位变化发现，CA作为乳化剂制备的样品在贮藏过程中平均粒径没有明显的变化(图1)，且始终维持高电负性来抑制液滴聚结和絮凝[18-20]。因此，与其他乳化剂相比，CA作为乳化剂制备的样品物理稳定性最好。

2.2.2 不同种类乳化剂对cis-Lyco-NLC样品贮藏期间外观变化的影响

观察不同种类乳化剂制备的cis-Lyco-NLC样品在45℃贮藏10 d前后的外观变化发现，Tween80作为乳化剂制备的样品在贮藏10 d后样品颜色由橙红变为淡黄，Q-Naturale和WPI作为乳化剂制备的样品在贮藏10 d后样品颜色变化较小，样品颜色仍为橙色，CA作为乳化剂制备的样品依然表现为较强的橙红色，并且在贮藏后看起来是均匀的，表明没有发生液滴聚集。另一方面，在Tween80和WPI作为乳化剂制备的样品顶部存在明显的黄色层，贮藏10 d后表面有油上浮。

2.2.3 不同种类乳化剂对cis-Lyco-NLC样品化学稳定性的影响

图3为不同种类乳化剂制备的cis-Lyco-NLC样品在贮藏过程中颜色变化情况。

由图3A可见，在贮藏期间，CA、WPI以及Q-Naturale作为乳化剂制备的样品亮度(L*)变化不大，表明在这些体系中油滴的光散射效率没有明显变化[21]。相反，由Tween80制备的样品亮度在贮藏期间明显增加，这可能主要是由于体系中颜色吸收急剧下降(特别是a*值)所致。由图3B和图3C可见，贮藏初期，cis-Lyco-NLC样品都具有较高的a*值(约40)和b*值(约52.5)，具有黄红色外观。贮藏期间，所有样品的a*值逐渐降低，表明红色变浅，其中Tween80制备的样品a*值比其他3种体系降低得更明显，所有样品在贮藏过程中b*值均有升高，表明样品中番茄红素在贮藏期间有所降解。由图3D可见，在贮藏期间所有样品的彩度均发生了不同程度的变化。WPI和Q-Naturale作为乳化剂制备的样品ΔC*值变化程度大致相同(1.5～6)，CA作为乳化剂制备的样品ΔC*值变化最小(0.6～3.3)，而Tween80作为乳化剂制备的样品ΔC*值变化显著(1.5～12.4)。由图3E可知，所有样品在贮藏期间总颜色均发生了变化。CA制备样品的ΔE值由1.7增加到4.0，抑制总颜色变化最有效，Tween80作为乳化剂制备的样品ΔE值由1.8增加到16.3，抑制样品总颜色变化效果最差，而WPI和Q-Naturale抑制样品总颜色变化效果一般，ΔE值由1.8增加到7左右。结合物理稳定性实验结果可知，由CA作为乳化剂形成的界面层可以保护cis-Lyco-NLC样品免于聚结，cis-Lyco-NLC样品的物理和化学稳定性最好，且有利于减缓样品中类胡萝卜素的降解速度。

2.3 cis-Lyco-NLC样品的贮藏稳定性

以GMS和牡丹籽油为固液脂，CA为乳化剂，按照1.2.1方法制备cis-Lyco-NLC，所制备样品的包封率为94.6%，载量为3.72%，平均粒径为185.63 nm。对所制备样品的贮藏稳定性进行研究，结果见图4。

图4 不同贮藏温度对cis-Lyco-NLC样品中番茄红素保留率的影响

由图4可知，贮藏温度对cis-Lyco-NLC样品中番茄红素的保留率影响较大，在-18℃或4℃低温贮藏环境下包埋在NLC中的番茄红素含量变化不明显，贮藏35 d番茄红素保留率仍在90%以上，当贮藏温度为25℃和45℃时，番茄红素保留率下降明显，特别是在45℃时贮藏35 d，番茄红素保留率下降到60.6%，说明高温加速了番茄红素的降解，使得样品中番茄红素含量下降。贮藏实验结果表明，低温贮藏能有效延缓cis-Lyco-NLC样品中番茄红素的降解。

表2列出了在不同贮藏温度和时间下cis-Lyco-NLC样品的平均粒径。

表2 不同贮藏温度对cis-Lyco-NLC样品平均粒径的影响(平均值±SD，n=3)

由表2可知：在4℃贮藏温度下，样品的平均粒径变化较小，贮藏35 d后样品的平均粒径从185.63 nm增加到199.65 nm；在25℃贮藏温度下，贮藏35 d后样品的平均粒径从185.63 nm增加到243.76 nm；在45℃贮藏温度下，样品的平均粒径变化更为明显，贮藏35 d后样品的平均粒径从185.63 nm增加到350.48 nm。说明当贮藏温度升高时，cis-Lyco-NLC样品中的液滴发生了聚集，造成液滴增大，这与文献[22-23]报道的其他NLC在贮藏期间平均粒径的变化一致。原因可能是随着贮藏温度升高，粒子的动能逐渐增强，加速液滴间的碰撞使其聚集形成大颗粒。此外，cis-Lyco-NLC样品在-18℃贮藏温度下，平均粒径大幅度增加。可能的原因是在冷冻过程中，样品形成大量的冰晶，导致液滴聚集使得样品的平均粒径增大。通过贮藏实验结果发现，在4℃的贮藏条件下，有利于维持cis-Lyco-NLC样品平均粒径的稳定，且番茄红素保留率也维持在90%以上。

3 结 论

本文通过筛选富含ω-3多不饱和脂肪酸的液态脂和天然乳化剂制备功能性更强的cis-Lyco-NLC稳定体系。固液脂筛选结果表明，乳化剂为Tween80时，纳米结构脂质载体的固液脂组合为GMS和牡丹籽油(固态脂与液态脂质量比3∶1)，所制备样品的包封率高达92.10%，载量为3.68%，且平均粒径为212.61 nm，稳定性好。乳化剂筛选结果表明，天然乳化剂CA制备的cis-Lyco-NLC样品在45℃贮藏10 d后平均粒径保持在200 nm左右，物理化学稳定性最好。选定固液脂组合为GMS和牡丹籽油(固态脂与液态脂质量比3∶1)、乳化剂为CA制备cis-Lyco-NLC，其包封率为94.6%，载量为3.72%，平均粒径为185.63 nm，在4℃下贮藏35 d后，cis-Lyco-NLC样品的平均粒径始终小于200 nm，番茄红素保留率在90%以上。