长链非编码RNA调控间充质干细胞成软骨分化的研究进展

姚楠 李聪聪 宋敏 许学猛 刘文刚 陈国材 陈国茜 叶国柱

[摘要] 修复骨关节炎（OA）引起的关节软骨损伤一直是关节外科的热点与难点。近年来间充质干细胞成为了软骨修复和细胞治疗方面受人关注的细胞。长链非编码RNA（lncRNA）是指一类转录本长度超过200 nt、不编码蛋白质的RNA。最近的研究表明，lncRNA在间充质干细胞成软骨分化过程中呈现出明显的差异表达，并且在间充质干细胞成软骨分化过程中发挥着重要的调控作用。本文综述了lncRNA DANCR、lncRNA HOTAIRM1-1、lncRNA ROCR、lncRNA ZBED3-AS1和lncRNA HIT调控间充质干细胞成软骨分化的研究，并探讨了当前研究存在的问题，以期將来为OA的细胞治疗提供参考。

[关键词] 长链非编码RNA;间充质干细胞;分化;软骨细胞

[中图分类号] R329.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）09（c）-0033-04

Research progress on regulation of long non-coding RNA in differentiation of mesenchymal stem cells into chondrocytes

YAO Nan1   LI Congcong2   SONG Min2   XU Xuemeng3   LIU Wengang3   CHEN Guocai2   CHEN Guoqian2   YE Guozhu2

1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Research and Development in Traditional Chinese Medicine， Guangdong Province Engineering Technology Research Institute of Traditional Chinese Medicine， Guangdong Province， Guangzhou   510095， China; 2.the Fifth Clinical Medical College， Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangdong Province， Guangzhou   510095， China; 3.Department of Orthopedics， Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital， Guangdong Province， Guangzhou   510095， China

[Abstract] Repair of articular cartilage injury caused by osteoarthritis （OA） has always been a hotspot and difficult point in joint surgery. Mesenchymal stem cells have become the focus of cartilage repair and cell therapy in recent years. Long non-coding RNA （lncRNA） refers to a class of RNA whose transcript length exceeds 200 nt and does not code for proteins. Recent studies have shown that lncRNA is significantly differentially expressed during the differentiation of mesenchymal stem cells into chondrocytes and plays an important role in the process of the differentiation of mesenchymal stem cells into chondrocytes. This paper reviews the research on regulation of lncRNA DANCR， lncRNA HOTAIRM1-1， lncRNA ROCR， lncRNA ZBED3-AS1 and lncRNA HIT in differentiation of mesenchymal stem cells into chondrocytes， and discusses the existing problems in current studies， in order to provide references for the future cell therapy of OA.

[Key words] Long non-coding RNA; Mesenchymal stem cells; Differentiation; Chondrocyte

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种中老年人常见的退行性疾病，其重要特征是关节软骨的退变和损伤。由于缺乏神经分布和血管供应，关节软骨一旦受损则很难自我修复[1]。因此关节软骨损伤修复一直是关节外科研究的热点与难点。间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是来源于中胚层的多能干细胞，具有自我更新和多向分化的潜能[2]，在一定条件下可以定向分化成软骨细胞，并在关节软骨修复中发挥重要的作用[3]。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类转录本长度超过200 nt、不编码蛋白质的RNA，长期以来被认为是基因组中的“暗物质”。近年来的研究发现lncRNA可参与多种干细胞分化和机体发育过程，并与RNA、增强子和修饰染色质的蛋白质复合物产生复杂的相互作用网络[4]，从而影响机体的生命活动以及疾病的发生和发展。最新的研究表明，lncRNA在调控MSC成软骨分化过程中发挥着重要的调控作用，可能是关键的调控位点[5-6]。

1 MSC向软骨分化的潜能

MSC最早由Friedenstein等[7]于1974年在骨髓中发现，后来研究表明MSC存在于脐带、脐血、脂肪及胎盤等多种组织中，具有很强的自我更新和多向分化潜能，在处于适宜的体内或体外诱导环境下可以分化为软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞和神经细胞等。目前，动物实验和临床试验均有应用MSC修复软骨损伤的报道。Zhang等[8]将兔脂肪来源的MSC接种在聚L-谷氨酸和壳聚糖交联制备的三维多孔支架材料上，发现MSC在这种支架材料内可自发地形成细胞聚团，而且这些细胞聚团在支架内部能够有效地进行成软骨分化，并在动物模型中成功修复了软骨损伤。Jo等[9]评估了关节内注射自体脂肪组织来源的MSC治疗OA的安全性和有效性，发现膝关节注射MSC的OA患者在注射6个月后没有出现不良反应，并且高剂量组患者膝关节软骨缺损部位有透明样的软骨出现。Vega等[10]将异体骨髓来源的MSC注射入OA患者的膝关节腔，并与注射透明质酸的患者比较，术后跟踪患者的疼痛、残疾以及生活质量状况达1年，核磁共振成像表明注射MSC的患者软骨缺损得到了更好的修复。Kim等[11-12]的临床研究发现膝关节部位的MSC注射和植入均能有助于修复OA患者膝关节的软骨损伤，并且采用MSC植入的方式比注射效果更好。Pleumeekers等[13]研究发现人脂肪组织和骨髓来源的MSC可以替代80%的软骨细胞而不影响软骨基质的产生及稳定性。总体来说，目前基于MSC的细胞疗法应用于临床软骨损伤修复治疗的病例较少，深入探讨MSC成软骨分化的机制将有助于临床OA细胞疗法的完善和优化。

2 lncRNA调控MSC成软骨分化

lncRNA是最近公认的一类非编码RNA，是RNA聚合酶Ⅱ的转录产物，其占到非编码RNA的80%以上，但却是目前研究及了解最少的一类RNA。最新的人类基因组注释（第20版，GRCh38）鉴定了来自14 470个lncRNA基因的24 489个lncRNA转录本[5]。根据它们在基因组中的位置可以分为正义lncRNA、反义lncRNA、双向lncRNA、基因内lncRNA和基因间lncRNA等[14-15]。Wang等[16]首次使用lncRNA芯片检测了lncRNA在人骨髓MSC成软骨分化过程中的表达，结果发现有3638个lncRNA出现明显的差异表达（倍数变化>2.0或<-2.0，P < 0.05），其中2166个lncRNA表达上调，1472个lncRNA表达下调。这些差异表达的lncRNA可能参与调控了MSC向软骨分化，值得深入研究。近年来，关于MSC成软骨分化过程中lncRNA的研究还很少，目前主要有关于lncRNA DANCR、lncRNA HOTAIRM1-1、lncRNA ROCR、lncRNA ZBED3-AS1和lncRNA HIT等的研究。

2.1 lncRNA DANCR调控MSC成软骨分化

lncRNA DANCR是一种最早在表皮细胞中被发现的高表达lncRNA，它维持表皮细胞处于未分化状态[17]。研究发现lncRNA DANCR可以调控CTNNB1基因的表达进而引起CTNNB1基因下游通路如Wnt通路的改变[18]。由于Sox4促进滑膜MSC增殖和软骨形成，而Sox4可以直接与lncRNA DANCR的启动子结合并增加其表达，因此调控Wnt通路可能是Sox4诱导lncRNA DANCR进而促进滑膜MSC增殖和成软骨分化的一种机制[19]。深入研究表明lncRNA DANCR直接与myc、Smad3和STAT3 mRNA相互作用以调控它们的稳定性，并且lncRNA DANCR诱导滑膜MSC增殖依赖于myc，促进滑膜MSC成软骨分化与上调Smad3和STAT3表达有关[20]。另外，通过miRNA芯片检测发现过表达lncRNA DANCR的滑膜MSC中miR-1305出现明显的下降。miR-1305过表达抑制了lncRNA DANCR诱导的滑膜MSC增殖和成软骨分化，这表明miR-1305拮抗了lncRNA DANCR的功能。进一步研究发现TGF-β信号通路中的Smad4是miR-1305调控的下游靶基因，而Smad4有助于lncRNA DANCR发挥促进滑膜MSC增殖和成软骨分化的作用。总之，研究表明调控miR-1305-Smad4轴是lncRNA DANCR促进滑膜MSC成软骨分化的另一种机制[21]。值得一提的是，研究还发现lncRNA DANCR在OA软骨组织中表达明显升高，并且可以充当miR-216a-5p的竞争性内源RNA。lncRNA DANCR可以通过调控miR-216a-5p/JAK2/STAT3信号通路促进OA软骨细胞的增殖，抑制细胞凋亡[22]。综上所述，lncRNA DANCR不仅是调控MSC成软骨分化的重要物质，也是直接干预软骨细胞生物学功能的重要物质，有望成为临床治疗OA的一个突破点[23]。

2.2 lncRNA HOTAIRM1-1调控MSC成软骨分化

Xiao等[24]在OA软骨样本中发现lncRNA HOTAIRM1-1表达明显降低，而miR-125b表达明显升高;lncRNA HOTAIRM1-1表达在诱导MSC成软骨分化后4 d升高，并在8 d后进一步升高，而miR-125b具有相反的表达变化。这些结果表明两者存在反向的表达。抑制lncRNA HOTAIRM1-1表达可以抑制MSC增殖，诱导MSC凋亡并且抑制MSC软骨分化。此外，lncRNA HOTAIRM1-1负调控miR-125b的表达，而miR-125b通过靶向骨形态发生蛋白受体2（bone morphogenetic protein receptor 2，BMPR2）调控MSC增殖、凋亡和软骨分化。最终结果表明lncRNA HOTAIRM1-1表达下调可能是通过调控miR-125b/BMPR2轴抑制MSC增殖、诱导凋亡和抑制软骨分化，并且其可能激活JNK/MAPK/ERK信号通路从而促进OA的发展[24]。以上研究表明lncRNA HOTAIRM1-1是OA发病以及细胞疗法中一个值得关注的新靶点。

2.3 lncRNA ROCR调控MSC成软骨分化

Barter等[25]通过lncRNA测序，从股骨颈骨折患者髋关节软骨中获得了许多lncRNA的转录本。其中一种调节软骨分化的RNA即lncRNA LOC102723505，也被称为lncRNA ROCR。已有研究表明Sox9是一种可以调控软骨分化的转录因子[26]。在MSC成软骨分化过程中，lncRNA ROCR和Sox9表达均显著升高。当抑制lncRNA ROCR表达后，Sox9、Col2a1和Acan表达水平明显降低，因而推测出lncRNA ROCR可能位于Sox9上游发挥调控作用[25]。总之，提高lncRNA ROCR表达有助于MSC的Sox9表达和软骨分化，将来可能在软骨损伤细胞疗法中发挥作用。

2.4 lncRNA ZBED3-AS1调控MSC成软骨分化

基于人骨髓MSC成软骨分化的lncRNA芯片研究结果发现，lncRNA ZBED3-AS1在诱导分化7 d时表达显著升高，在14 d时达到顶峰，并一直持续到28 d，表明其是骨髓MSC成软骨分化过程中表达量最高的lncRNA之一，在早期软骨分化中起着关键的调控作用[16]。Ou等[27]进一步研究发现lncRNA ZBED3-AS1在人滑膜液MSC中的过表达可通过上调zbed3表达，进而激活参与软骨形成的Wnt/β-catenin信号通路来增强软骨分化的潜能。并且Wnt通路抑制剂DKK1可以逆转lncRNA ZBED3-AS1对软骨形成的促进作用。因而，由于lncRNA ZBED3-AS1在人滑膜液MSC成软骨分化中发挥了调控作用，其可能有助于OA的治疗。

2.5 lncRNA HIT调控MSC成软骨分化

除了以上关于成体组织MSC成软骨分化研究外，在E11小鼠胚胎未分化的四肢MSC中发现lncRNA HIT存在高表达，定位于细胞核内，并且形成lncRNA-HIT-p100/CBP复合体。运用siRNA干预LncRNA HIT表达会减少四肢MSC凝聚，抑制四肢MSC的软骨形成。深入研究表明lncRNA HIT siRNA的干预通过降低H3K27ac或p100活性影响了促软骨形成相关基因的表达，最终抑制了复合体对软骨形成的促进作用[28]。因此，这些研究结果表明lncRNA HIT在四肢成软骨分化过程中发挥着重要作用。

3 讨论

目前运用MSC进行细胞治疗干预OA软骨损伤和修复成为了热点。lncRNA是广泛存在于哺乳动物细胞中的一类非编码RNA，近年来人们陆续发现了其在各种疾病的发生发展过程中均扮演了重要角色，并且还发现lncRNA在调控MSC成软骨分化过程中发挥着重要作用。然而，尽管当前lncRNA芯片技术已筛选出MSC成软骨分化过程中大量明显差异表达的lncRNA，但只有其中一小部分lncRNA被研究了，并且相关研究还不够深入和全面。总体来说，现阶段对于lncRNA调控MSC成软骨分化的研究还处在初级阶段。未来的相关研究应该充分运用lncRNA芯片、lncRNA测序以及生物信息学等新技术和新方法，从编码RNA即mRNA、非编码RNA如miRNA和circRNA等、蛋白及信号通路等水平上对lncRNA进行深入研究，找到目标lncRNA所参与的分子生物调控网络，这样才能对其有准确的认识[29]。另外，考虑到单一lncRNA的调控作用有限，有必要考虑组合运用lncRNA来发挥调控作用[30]。总之，研究lncRNA调控MSC成软骨分化在关节软骨损伤修复中具有重大意义，对lncRNA的深入研究有望推进临床OA细胞疗法的广泛应用。

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（收稿日期：2019-05-06  本文编辑：张瑜杰）