寻常型银屑病中DUSP1和DUSP4的表达

孙献琪 栗玉珍

银屑病是一种常见的免疫介导的慢性炎症性皮肤病，具有冬重夏轻的特点，严重影响患者的生活质量[1]。而银屑病的病因复杂，发病机制目前仍不清楚，目前认为与遗传因素、环境因素及免疫因素等相关[2]。虽然银屑病发生发展的早期阶段仍不清楚，但普遍认为MAPK信号通路异常与银屑病的发病关系密切。研究发现，银屑病皮损区 MAPK信号的磷酸化细胞外信号蛋白调节激酶(phosphorylated extracellularsignal-regulated kinace, P-ERK)的活性明显高于非皮损区，治疗前银屑病皮损ERK活性明显高于治疗后。而MAPK信号的输出取决于MAPK磷酸化的程度和持续时间，这表明信号失活机制与级联信号本身的活化一样重要。双特异性磷酸酶(dual specificity phosphatase，DUSP)是一类广泛参与机体内信号传导、生长发育的具有酪氨酸特异性的磷酸酶。它可以介导磷酸丝氨酸/磷酸苏氨酸和磷酸残留的MAPK的去磷酸化，是一种MAPK的负调节剂。目前已知DUSPs在调节血管生成因子下游MAPK信号通路中发挥重要作用，而MAPK信号通路异常与银屑病的发病关系密切，但DUSPs与银屑病的相关性在国内外学者中却无人探究。

本实验应用Real-timePCR和Western blot方法检测寻常型银屑病和正常对照组的组织中DUSP1和DUSP4的表达情况，从而探讨DUSP1和DUSP4与寻常型银屑病发病的关系，为阐明银屑病的发生发展机制提供重要的理论支持。

1 材料与方法

1.1 一般资料 经哈尔滨医科大学附属第二医院伦

理委员会的批准，并经过患者的知情同意取18例就诊于本院皮肤科门诊和病房患者的新鲜皮损，取材部位是躯干和四肢。临床表现均是典型的局限或广泛分布的鳞屑性的红斑或者斑块，通过两位病理科医师进行组织病理学确定诊断，取材前三个月未系统外用治疗银屑病的药物如糖皮质激素、免疫抑制剂等。15名正常对照组皮肤组织来自哈尔滨医科大学附属第一医院整形美容科的面部美容手术患者，均无皮肤疾病。

1.2 试验仪器及试剂 兔抗人多克隆抗体DUSP1购于美国Abcam公司，DMEM培养基、胰蛋白酶购于美国GIBCO公司，二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司。全蛋白抽提试剂盒、Western Blotting和Real-timePCR 检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。DUSP1上游引物5’- GAGCTGTGCAGCAAACAGTC-3’，下游引物5’- GTCTGCCTTGTGGTTGTCCT -3’，DUSP4上游引物5’- TCACGGCTCTGTTGAATGTC -3’，DUSP4下游引物5’- GATGTCGGCCTTGTGGTTAT -3’，β-actin上游引物5’-CCCTGGCACCCAGCAC-3’，下游引物5’-GCCGATCCACACGGAGTAC-3’引物序列均由上海英俊生物工程有限公司提供。

1.3 Real-time PCR检测寻常型银屑病DUSP1和DUSP4的表达 从-80℃冰箱内取出冻存管中的试验组和对照组的皮肤组织，进行新鲜组织总RNA提取及反转录，反转录PCR反应体系为总反应物20 μL，包括总RNA 1 μL，引物为 2 μL，dNTPs(10 mM)1 μL，5*TS RT Buffer 5 μL，TransScript RT 1 μL，Rnase-free Water 10 μL见表1。采用PCR仪进行扩增。Real-time PCR反应条件为：94℃变性5 min,94℃ 变性 10 s,57℃ 退火30 s,65℃ 5 s(45个循环),72℃终延伸5 min。

表1 Real-time PCR 反应体系

1.4 Western blot检测寻常型银屑病DUSP1和DUSP4的表达 组织收集后，转至新的预冷的离心管中并加入配制好的冷Lysis Buffer并置于玻璃匀浆器中，手动匀浆，低温操作；14,000 r/min，4℃离心15 min，分离上清即为全蛋白提取物，蛋白定量；分装保存于-70℃，避免反复冻融。严格按照说明书步骤进行制胶、上样、电泳、转模、印记等操作步骤。

1.5 统计学方法 所用的数据都是以均数±标准差的方式表达。两组之间的均数比较采用t检验。P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 寻常型银屑病患者与对照组中DUSP1mRNA和DUSP4mRNA的表达水平检测 为探寻寻常型银屑病患者皮肤组织中DUSP1mRNA和DUSP4mRNA的表达情况，我们用Real-time PCR技术检测寻常型银屑病患者皮肤组织和正常对照组组织中DUSP1mRNA和DUSP4mRNA的表达水平。银屑病组DUSP1 mRNA的相对表达量为0.0939±0.0048, 正常对照组为0.2486±0.0060,P<0.05。银屑病组DUSP4mRNA的相对表达量为0.3718±0.0370,正常对照组为0.3645±0.0286,P>0.05(图1)。结果显示与正常皮肤组织相比，DUSP1mRNA在寻常型银屑病中表达水平明显降低而DUSP4mRNA在银屑病中表达水平没有变化(图1)。

*P<0.05

2.2 Western blot检测DUSP1蛋白和DUSP4蛋白的表达 为了检测在寻常型银屑病皮肤组织中DUSP1蛋白和DUSP4蛋白的表达量，我们用Western blot提取对照组和实验组的蛋白进行了检测。银屑病组DUSP1蛋白的相对表达量为0.5165±0.0254, 正常对照组为1.2432±0.3260,P<0.05。银屑病组DUSP4蛋白的相对表达量为0.8018±0.0770,正常对照组为1.3677±0.2287,P>0.05(图2)。结果发现，与对照组相比寻常型银屑病患者皮肤组织中的DUSP1蛋白表达水平下调而DUSP4组没有明显变化(图2)。

3 讨论

银屑病是一种常见的慢性免疫介导的炎症性皮肤病，全世界上约1%～3%的人群饱受其困扰[3,4]。银屑病不仅是一种皮肤病，而且是一种系统性疾病[5,6]。到目前为止，人类对银屑病发病机制的认识都处于初级阶段。目前对银屑病发病机制的研究普遍认为MAPK信号通路的异常与银屑病的发病关系密切。DUSPs可以介导MAPK的去磷酸化，是MAPK的负调节剂。而在调节血管生成因子下游MAPK信号通路中,DUSPs发挥着重要作用,并且DUSPs在炎症性疾病中的作用也被研究证明。但DUSPs在寻常型银屑病发病机制中的作用和意义在国内外文献中却未见报道。

*P<0.05

本实验研究通过检测和比较寻常型银屑病的皮损组织与正常人对照组皮肤组织中DUSP1和DUSP4的表达量，发现DUSP1在寻常型银屑病皮损组织中表达水平相对较低，并且差异具有统计学意义(P<0.05)。发现DUSP4在寻常型银屑病皮损组织中表达水平和正常人对照组的组织中表达水平不存在明显差异，不具有统计学意义(P>0.05)。本研究的结果提示DUSP1与寻常型银屑病具有一定的相关性。

DUSP1基因位于人类染色体5q34,定位于细胞核中，它在炎症反应、血管生成、癌症、代谢、糖尿病等多种生理过程和疾病中发挥重要的生理作用[7]。DUSP1的去磷酸化作用主要依赖于MAPK信号通路。近些年来，研究证实DUSP1是炎症反应重要的负调控因素之一。DUSP1在炎症反应中发挥关键性作用，Shen等[8]发现，当用脂多糖刺激DUSP1基因敲出小鼠的巨噬细胞时，MAPK信号通路激活的强度与激活的时间均大于正常对照组，并同时出现白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等炎性因子的过度分泌。由此可见，DUSP1是炎症反应的重要的负调控因素之一。Czikk和Shen等[9,10]研究证明上调血管内皮细胞中DUSP1的表达，抑制了p38MAPK信号通路的活性从而抑制TNF-α介导了血管内皮通透性增加，进而可以抑制粥样斑块的形成。可见，DUSP1参与调节体内炎症的强度，有可能成为治疗炎症相关疾病的新方向。

本实验有一定局限性和不足之处。实验选择的样本的数量相对较少且均为中国东北地区的银屑病患者。由于本研究的方法的局限性，尚未发现DUSP1对银屑病具体的作用机制。在今后的研究中，本课题组还要继续上述作用机制的研究，使本课题的理论依据更加完善。探讨DUSPs与寻常型银屑病发病机制的关系，为阐明寻常型银屑病的发生发展机制提供一定的理论支持。