肝癌患者肿瘤组织和血清lncRNAs水平变化的研究

2019-11-18王一涵冯亚星刘卫辉

西南国防医药 2019年10期

王一涵，冯亚星，刘卫辉

肝细胞肝癌(HCC)是癌症死亡的第三大缘由之一的恶性肿瘤[1]。由于HCC具有侵袭性强、转移率高和隐蔽性强等特点，大多数HCC患者确诊时已为中晚期[2]。目前，影像学检查和肿瘤标志物检测为HCC的早期诊断与筛查的两大类检测手段。传统的影像学检查依赖于操作者的技术和经验，使HCC的早期诊断存在有一定的误差[3]。此外，近年来研究发现，肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)在HCC患者中存在一定的假阴性，特异性不尽如人意。因此，寻找高效的HCC早期预测诊断标志物，将有利于提高HCC患者的生存率[4]。

近年来研究发现，长链非编码RNA(lncRNA)能够发挥许多重要的生物学功能，可通过外源性沉默、剪切调控、作为ceRNA与对应miRNA相作用、与蛋白质相互作用以及遗传变异等多种方式调控基因表达[5]。许多lncRNAs通过影响肿瘤细胞的生长、凋亡、浸润与转移等生理过程成为新的肿瘤标志物的重要来源[6]。本研究结合已有研究及文献报道，挑选了4个与肿瘤发生密切相关的lncRNAs，包括lncRNA HOTAIR[7]、lncRNA HOTTIP[8]、lncRNA DANCR[9]和lncRNA TCF7[10]，这些lncRNAs密切调控上皮-间质转化(EMT)过程及肿瘤干细胞特性维持。本研究通过检测上述lncRNAs在HCC组和对照组组织和血清中的表达情况，讨论其作为HCC早期诊断标志物的潜在价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 病例资料选取医院2017年9月～2018年9月收治的28例HCC患者（HCC组），以及同期12例肝血管瘤患者（对照组），均经组织病理学检查确诊。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者及其家属均知情同意。

1.2 标本取材及处理所有受试者均用干燥采血管抽取其外周静脉血各4 ml，于4℃静置≥0.5 h。离心机在4℃400 r/min条件下离心10 min；取上清，之后4℃ 1800 r/min再离心10 min，最后得血清待测。另收集患者手术切除的肝血管瘤组织和HCC患者的癌组织和癌旁组织（距癌组织边缘超过2 cm，病理检查未见癌细胞）标本。

1.3 检测指标取上述血清和组织标本，分别使用TRI REAGENT BD和TRIZOL（美国加州Invitrogen life technologies）试剂提取总RNA[11]。将所得的RNA根据反转试剂盒使用操作说明书将其反转录成cDNA。用Real-time PCR检测组织和血清中lncRNAs的相对表达量，采用 2×PCR master mix（Arraystar），取适量cDNA作为摸板，10 μl体系进行扩增，以β-actin为内参基因。

1.4 统计学方法应用SPSS 18.0统计软件分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用One-way ANOVA分析，两组间比较采用t检验；评估HCC的诊断价值时，通过受试者工作特征曲线下面积(AUC)进行评估；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织中各lncRNAs的表达水平比较 HCC癌组织中，lncRNA DANCR和lncRNA TCF7相对表达量明显高于肝血管瘤组织和癌旁组织 (P＜0.05)，而 lncRNA HOTAIR 和 lncRNA HOTTIP相对表达量与肝血管瘤组织与癌旁组织相对表达量则无明显差异(P＞0.05)。见表1

表1 两组组织中各lncRNAs表达水平比较

2.2 血清中各lncRNAs表达水平比较与对照组比，HCC组血清中 lncRNA DANCR和 lncRNA HOTTIP表达量显著上调(P＜0.05)，lncRNA HOTAIR和lncRNA TCF7的表达量则无显著差异(P＞0.05，表2)。

表2 两组血清中各IncRNAs表达水平比较

2.3 血清lncRNAs表达水平对HCC的诊断效能血清lncRNA HOTAIR诊断HCC的AUC为0.563(95%CI：0.387～0.738,P＞ 0.05)，lncRNA DANCR 为0.821(95%CI：0.677～0.966,P＜ 0.05)，lncRNA HOTTIP为0.902(95%CI：0.806～0.998,P＜ 0.01)，lncRNA TCF7为0.563(95%CI：0.347～0.778,P＞ 0.05)。联合 lncRNA DANCR和lncRNA HOTTIP检测诊断的AUC为0.929(95%CI：0.808～0.996,P＜ 0.01)，见图 1、2。

3 讨论

HCC作为一种世界范围内高发的癌症，大多数HCC患者在确诊时已是中晚期。目前亟待解决的问题就是寻找稳定可靠的肿瘤标志物，改善HCC缺乏有效早期诊断手段的难题。

近年研究发现，lncRNA是调节多种生物过程的重要参与者，lncRNA的异常表达与肿瘤的发生密切相关[12]。据报道，lncRNA可作为竞争性内源RNA（ceRNA）进行调控，以便在转录后与其他RNA转录物进行通信[13]。Chang等研究发现，lncRNA XIST被加工成microRNA片段（miRNA-181a），它可以通过靶向PTEN促进 HCC转移[14]。lncRNA HULC、lncRNA PVT1、lncRNA ATB、lncRNA DANCR、lncRNA HEIH等先后被报道在原发性肝癌组织中差异表达，与肝癌发生、发展密切相关。因此，lncRNA被认为是HCC患者预后和预测的生物标志物。

本研究主要立足于肿瘤干细胞及EMT过程，这两个与HCC发生密切相关的生物学事件，选择与二者密切相关的 4个 lncRNAs（lncRNA HOTAIR、lncRNA HOTTIP、lncRNA DANCR和lncRNA TCF7）进行研究。Zhang等[15]研究发现，lncRNA HOTAIR通过Wnt信号通路调节EMT过程，通过维持干细胞特性参与肝癌的发生与发展过程。与此同时，lncRNA HOTTIP因为与lncRNA HOTAIR来源的位置相近，同时也与EMT过程及肿瘤干细胞特性维持密切相关[16]。Liu等[17]研究指出，lncRNA DANCR在干细胞样肝癌细胞中过表达，可以通过调节EMT过程进而与肝癌发生密切相关。Yan等[18]研究发现，lncRNA TCF7在HCC细胞和肝癌干细胞中高表达，并且lncRNA TCF7能诱导EMT过程的发生。

本研究结果显示，在HCC患者癌组织中，lncRNA DANCR和lncRNA TCF7水平表达显著上调，而lncRNA HOTAIR和lncRNA HOTTIP水平表达则无显著差异。而在HCC患者血清中，lncRNA HOTTIP和lncRNA DANCR的相对表达量均显著上调。最后为了评估所选lncRNAs对HCC的诊断效能，本研究根据血清4个lncRNAs表达水平绘制ROC曲线，结果显示，血清lncRNA HOTTIP和lncRNA DANCR联合检测的诊断效能最佳，其AUC为0.929。