箭筈豌豆新品种DUS测试指南研制—测试性状评价和参照品种筛选

闵学阳，刘文献，王彦荣*，林晓珊，齐晓，张正社，聂斌

(1.兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室，兰州大学农业农村部草牧业创新重点实验室，兰州大学草地农业科技学院， 甘肃 兰州 730020；2.全国畜牧总站，全国草品种审定委员会办公室，北京 100125)

植物新品种保护制度是农业领域所特有的一项重要知识产权制度，对鼓励种业投资、激励育种创新、加速植物新品种转化运用具有不可替代的作用[1-2]。《国际植物新品种保护公约》(The International Union for the Protection of New Varieties of Plants, UPOV公约)的保护形式是对符合特异性(distinctness)、一致性(uniformity)、稳定性(stability)(简称 DUS )测试要求的植物新品种授予保护，以保护育种者权利[3]。截止2019年4月10日，我国已公布了21项DUS测试国家标准和177项DUS测试行业标准，其中花卉为40(23%)项、蔬菜为38(21%)项、大田作物为32(18%)项、果树为26(15%)项、牧草为12(7%)项、药用植物为10(6%)项，菌类为7(4%)项、其他12(7%)项(http://www.nybkjfzzx.cn/p_duscs/duscs.aspx)。总体而言，自1991年开始实施植物新品种保护制度以来，我国DUS测试经历了从无到有、从少到多、从弱到强的发展过程，整体呈现快速发展的态势。

我国新颁布的《中华人民共和国种子法》[4]规定，2016年1月1日以后申请的植物新品种应满足特异性、一致性、稳定性3个要求。2017年，农业农村部共受理国内外品种权申请3842件，位居UPOV成员第一位，标志着我国已成为植物新品种保护大国(http://www.moa.gov.cn/)。因此，DUS 测试无论在品种审定、登记还是保护中都起着重要作用，对于提升我国育种水平和促进育种原始创新都具有积极的推动作用。

DUS测试指南的主要内容包括：总体技术要求(适用对象、繁殖材料的要求、测试安排、性状的观测与评价、分组性状和性状及符号)、性状表、性状解释、附录A性状表、附录B性状表的解释、附录C技术问卷等内容。其中，性状表的确定是DUS测试指南研制的核心内容，是判别申请品种是否具备三性的主要依据[3,5-6]。完整的性状表应由表达类型、表达状态、观测时期/方法/样本量、参照品种和每个表达状态对应的数字代码等部分组成。性状表达类型分为质量性状、数量性状和假质量性状；观测方法和记录类型包括：群体目测、个体目测、群体测量和个体测量。参照品种的恰当选择与确定，在判定参试品种是否具备特异性中发挥重要作用，可为性状的表达状态提供实例参考，降低测试员主观观测的误差，从而提高性状观测的准确性和客观性。因此，测试性状评价和参照品种筛选在DUS测试指南研制中起着举足轻重的作用。

箭筈豌豆(Viciasativa)是豆科野豌豆属一年生优质牧草，具有适应性广、营养价值高、适口性好等特性，普遍种植于我国长江中下游、华北和西北等省(区)[7-9]。另外，作为适宜高寒高海拔地区栽培的优良牧草，箭筈豌豆还可通过与燕麦(Arenasativa)混播，调制青干草，用于冬春补饲，是解决高山草原牧区家畜营养不足的有效措施，在我国草地农业系统中发挥着重要作用[10-11]。我国已培育出多个箭筈豌豆品种，例如，20世纪80年代，中国农业科学院兰州畜牧研究所育成的“333/A”箭筈豌豆具有早熟、耐旱、子实产量高、不裂荚等特点；90年代，江苏省农业科学院土壤肥料研究所育成的“6625”和“苏箭3号”箭筈豌豆，具有早熟、适应性广等特点。近年来，兰州大学先后育成了针对青藏高原的系列品种，其中2014年审定登记的“兰箭3号”具有生育期短、种子产量高，种植范围可覆盖青藏高原海拔4000 m及以下地区等优势；2014年审定登记的“兰箭1号”，具有牧草产量高，可在海拔3000 m及以下地区生产种子等特点；2015年审定登记的“兰箭2号”，具有牧草和种子产量均较高的特点，可在青藏高原海拔3500 m及以下地区生产种子，该品种已列为农业农村部主推品种之一。2019年中央一号文件明确提出“加快选育和推广优质草种”，这是根据我国草种业发展现状做出的决策。伴随着培育高产量、高品质和早熟箭筈豌豆品种培育工作的逐步推进，我国箭筈豌豆DUS测试指南的研制已迫在眉睫。UPOV于2013年公布了箭筈豌豆DUS测试指南，共包括23个测试性状，35个参照品种，可为我国箭筈豌豆DUS测试指南的研制提供参考依据[12]。

本研究团队从2010年起，长期从事草类植物新品种DUS测试指南的研制工作，先后研制和颁布了《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 草地早熟禾》(NY/T2428-2013)[13]和《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 紫花苜蓿和杂花苜蓿》(NY/T2747-2015)[14]农业行业标准。相继在2017-2018年，承担了农业农村部下达的箭筈豌豆新品种DUS测试指南的研制项目，在指南研制过程中，以TG/1/3、TG/32/7等相关文件为技术指导[15-18]，并结合考虑我国箭筈豌豆育种水平和生产实际，在国内外广泛收集箭筈豌豆品种进行了连续多年的DUS测试性状的评价。项目已经完成了箭筈豌豆田间DUS性状测定和参照品种筛选，以及室内的DAN指纹图谱构建技术的研究[9]，为测试指南的研制积累了大量的测试数据和丰富的技术资料。本研究报道了箭筈豌豆新品种DUS测试指南研制的主要结果：测试性状的评价和参照品种的确定。旨在为我国箭筈豌豆新品种 DUS 测试指南的制定提供技术依据，为促进我国箭筈豌豆品种的审定、登记和保护工作的健康发展而服务。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

研究样地位于兰州大学草地农业科技学院榆中北山定位研究站，属于典型的半干旱黄土丘陵区，年降水量382 mm；年蒸发量1343 mm；年平均温度6.7 ℃；海拔1720 m；无霜期90～140 d。

1.2 试验品种

本试验参试品种共51个，分别由美国国家种质资源库、中国农业农村部全国畜牧总站、国家草种质资源库和兰州大学草地农业科技学院等单位提供(表1)。参试品种来自中国、前苏联、匈牙利、法国、美国等6个国家，我国的品种包括了已审定登记的主要品种13个：分别为兰箭1号、兰箭2号、兰箭3号、苏箭3号、苏箭3号(淮阴)、苏箭4号、苏箭5号、中牧324、6625、324、333/A、定西和6625大荚。在51个品种中，其中部分品种的形态等性状在课题组以往工作中也进行了研究[8,19]，为本试验参试品种的确定奠定了基础。

1.3 试验设计

田间试验采用完全随机区组设计，行株距均为60 cm，每份参试品种3次重复，每重复70株箭筈豌豆，试验田建植后按大田生产方式管理，及时处理病虫害。田间试验连续进行了两年(2017-2018年)，每年4月25日左右播种，5-11月进行性状观测。

1.4 测定性状、表达状态和观测方式

测试性状共计31个，包括UPOV箭筈豌豆DUS测试指南中的全部性状23个，以及以往研究认为有特异潜力的性状8个。UPOV 23个性状分别为：第二主叶长宽比、茎基部花青甙着色、叶片的绿色程度、初花期、茎上部节间绒毛、叶腋花青甙着色、叶片顶部形状、叶片宽度、托叶蜜腺花青甙颜色、花色、荚果绒毛、荚果长度(不包括分化的荚果尖部)、荚果宽度、荚果分化尖的长度、胚珠数、种子重量、种子形状、外种皮底色、种皮褐色形状、种皮褐色面积、种皮蓝黑色形状、种皮蓝黑色面积和子叶颜色；新增8个性状分别为：叶面积、叶长宽比、茎粗、植株生长习性、分枝数、炸荚性、每植株荚果数和荚果颜色。

依据《测试指南的研制》(TG/7)和TG/32/7文件对每个性状的表达状态和测试方法进行了规定[15]。表达类型分为质量性状(表达状态不连续的性状)、数量性状(表达状态覆盖了从一个极端到另一个极端之间的整个变异范围的性状)和假质量性状(表达范围至少部分连续，但在一个以上方向/维度上存在变异的性状)。在方法测试中质量性状和假质量性状的测定采用群体目测；数量性状测定：利用游标卡尺、直尺、色度计和天平等进行测量，叶长、叶宽和叶面积使用平板扫描仪(EPSON GT-15000)扫描叶片，然后利用WinSEEDLETM2011图像分析系统进行图像处理。

1.5 数据处理

表1 参试51个箭筈豌豆品种的名称和来源地Table 1 The information of 51 common vetch varieties in the experiment

2 结果与分析

2.1 UPOV箭筈豌豆DUS测试指南中的性状测定及参照品种确定

2.1.1测试性状的选择与评价 《植物品种特异性、一致性、稳定性测试总论》指出用于DUS测试的性状应满足：1)是特定的基因型或者基因型组合作用的结果；2)在特定环境条件下是可重复的；3)在品种间表现出足够的差异，可用于特异性判定；4)能够被准确识别和描述；5)满足一致性和稳定性的要求[20]。基于上述基本条件，对UPOV箭筈豌豆23个DUS 测试性状进行了评价，其中包括：16个数量性状、3个质量性状和4个假质量性状(表2)。

根据两年田间的实测结果对上述部分性状进行了补充和修改。TG/1/3文件指出形状可作为假质量性状，因此将叶片顶部形状和种子形状由数量性状修改为质量性状。性状“外种皮底色”在白色、灰绿色、灰褐色和褐色的分级基础上增加黄色和蓝黑色的表达状态；“种子形状”的表达状态由圆形、轻度不规则和极不规则的分级基础上增加近方形和椭圆形(表2)。

表2 箭筈豌豆DUS测试性状Table 2 The characteristics of common vetch DUS test

续表2 Continued Table 2

续表2 Continued Table 2

续表2 Continued Table 2

注：QL：质量性状；QN：数量性状；PQ：假质量性状；MG：群体测量；MS：个体测量；VG：群体目测；A：样本量为100个植株或100个植株的100个部位；B：样本量为200株； *：标注性状为UPOV用于统一品种描述所需要的重要性状；序号1～23为UPOV 23个箭筈豌豆DUS测试性状，序号24～31为8个新增性状。

Note: QL: qualitative characteristic; QN: quantitative characteristic; PQ: pseudo-qualitative characteristic; MG: single measurement of a group of plants or parts of plants; MS: measurement of a number of individual plants or parts of plants; VG: visual assessment by a single observation of a group of plants or parts of plants; A: sample size of 100 plants/parts of plants; B: sample size of 200 plants; *: The test guidelines which are important for the international harmonization of variety descriptions and should always be examined for DUS； the numbering of 1-23 represent UPOV common vetch DUS test characteristics; and the numbering of 24-31 represent 8 new characteristics.

2.1.2参照品种的确定 本试验共筛选出来自6个不同国家的32个箭筈豌豆参照品种，包括了我国已审定登记的品种11个：兰箭1号、兰箭2号、兰箭3号、苏箭3号、苏箭3号(淮阴)、苏箭4号、苏箭5号、中牧324、6625、324和333/A；法国的4个品种：Blanchegrain、Carole、Caroline和Vedoc；前苏联的3个品种：Stanislavskaya、Tyesisskaya、Votkinskaya；美国的5个品种：Cahaba white、Nova II、Vanguard、Vantage、Warrior；匈牙利的7个品种：Bogorodnjikaja 800、Charkovszkaja n.134、Rugener、Kabylie 130、Kamalinszkaja a-611、Osztrak tajfajta、Plov div和Strzeleche rdzowa；以及叙利亚的1个品种Line 715。

2.2 箭筈豌豆新增性状测定及参照品种确定

2.2.1测试性状的选择与评价 根据本课题组对收集到的箭筈豌豆种质资源形态等性状的观测，新增了8个能够稳定遗传、且具有特异性的观测性状，包括1个质量性状(炸荚性)、6个数量性状(叶面积、叶长宽比、茎粗、分枝数和每植株荚果数)和1个假质量性状(荚果颜色)。对新增性状的观测时期、方法、样本量和表达状态进行了评价和描述(表3)。观测时期分布在现蕾期到完熟期之间，现蕾期指标包括：叶面积、叶长宽比、茎粗和生长习性；荚果发育期包括：分枝数；50%的荚果成熟、种子呈现固有色泽、变硬到完熟期包括：每植株荚果数和荚果颜色；完熟期包括炸荚性，观测时期的划分详见表3。观测方式包括3个群体目测指标：生长习性、炸荚性和荚果颜色；5个群体目测或个体测量指标：叶面积、叶片长宽比、茎粗、分枝数和每植株荚果数。新增性状的观测样本量均为200个植株。

2.2.2参照品种的确定 本试验为新增的8个DUS测试性状共筛选出21个参照品种，包括国内品种8个：兰箭1号、兰箭2号、苏箭3号(淮阴) 、苏箭4号、苏箭5号、中牧324、324、6625；国外品种12个：Blanchegrain、Cahaba white、Carole、Kabylie 130、Line 715、Rugener、Strzeleche rdzowa、Tyesisskaya、Vanguard、Vantage、Vedoc和Warrior。上述参照品种均包含在UPOV箭筈豌豆DUS测试性状中确定的32个参照品种中。

2.3 箭筈豌豆生育阶段

本试验涉及的箭筈豌豆DUS测试性状分布于植株、茎、叶、花、荚果和种子等部位，不同部位的性状观测往往需要特定的时期，降低由于观测时期不同带来的差异，以保证获得最佳的判定结果。表3为箭筈豌豆31个性状所对应的全部观测时期，主要包括叶发育期、现蕾期、开花期、荚果发育期(绿熟期)、荚果和种子成熟期5个时期。

表3 箭筈豌豆生育阶段Table 3 Phenological growth stages of common vetch

2.4 分组性状的确定

使用分组性状可以将已知品种分组种植，从而选择出近似品种，而近似品种的临近种植则有助于不同品种间的特异性判定。依据TG/1/3测试总则4.8“性状的功能性分类”和UPOV箭筈豌豆DUS测试指南，对箭筈豌豆DUS测试性状可采用下列6个性状进行品种分组：a)开花时间；b)托叶：蜜腺花青甙颜色；c)种子：种皮底色；d)种子：种皮褐色形状；e)种子：蓝黑色斑纹；f)种子：子叶颜色。例如：测试品种植株种皮褐色形状为“点状”和子叶的颜色为“灰褐色”, 在田间种植时可以把种皮褐色形状为 “无”、“斑状”、“点状和斑状”，且子叶的颜色为“橘黄色”的已知品种排除。

2.5 箭筈豌豆品种 DUS 判定标准

根据UPOV公约(1961/1972、1978和1991文件)，一个品种必须与其他已知品种有明显区别才能满足特异性要求，而且差异必须具有稳定性。箭筈豌豆 DUS 的判定标准如下:

2.5.1特异性判定 特异性测试是DUS测试的核心，如果两个品种性状间的差异方向一致，而且差异是明显的，则认为这两个品种是可明确区分的。如果测试品种间差异非常显著，只需安排1个生长周期的种植试验，如环境因素等的影响导致品种间差异不显著，则需要至少2个生长周期的观测。明显的差异是指两个品种间性状表达的差异能够明显观测到或通过统计分析方法判定差异显著(排除环境变异的影响)。判断两个品种之间的差异是否明显取决于多种因素，尤其是性状的表达类型，即该性状是质量性状、数量性状还是假质量性状。

箭筈豌豆特异性测试的观测数量应满足在20个植株或20个植株的20个部位。两个品种的质量性状只要存在1个显著差异的性状，两个品种间即具备特异性。例如，质量性状“种子子叶颜色”(性状23)的表达状态可分为“灰褐色”和“橘黄色”(图1)。若测试品种和近似品种该性状上分属于不同的表达状态，可判定这2个品种间存在显著差异，具有特异性。

数量性状应满足两个品种间有1个性状≥2个代码的差异，或是2个以上性状具有显著差异，可判定测试品种间具备特异性。 例如，数量性状“幼苗第二主叶的长宽比”，表达状态分为“极低”、“低”、“中”、“高”、“极高”，分级代码为“1、3、5、7、9”，“Osztrak tajfajta”品种分级为“3”，“兰箭3号”品种分级为“7”，则可明确判定两个品种间具有特异性(图2)。当只有一个代码差异时，两个品种可能非常接近代码的临界值(如代码5的高端和代码6的低端)，则需利用测量值进一步比较两个品种是否具有明显差异，因为有时小于两个代码的差异也可能具有明显的差异。

图1 箭筈豌豆种子子叶颜色的表达状态分级Fig.1 The expression state of color of cotyledons in common vetch

图2 箭筈豌豆第二主叶长宽比的表达状态分级及对应的参照品种Fig.2 The expression state of the ratio length/width of second primary leaf and corresponded reference varieties in common vetch

假质量性状是部分连续的，在整个尺度上分布并不均匀，而且变异范围是多维的，很难确定出判定特异性所需要的代码差异。如：“种子种皮蓝黑色形状”(性状19)的类型为：无(代码1)；点状(2)；斑状(3)；点状和斑状(4)(图3A)，虽然代码分别为1和2的品种间的代码差别为1，1和4的品种间的代码差别为3，但不宜说后者比前者的差异明显。“花色”(性状10)的类型为：白色(代码1)；粉红色(2)；浅紫罗兰色(3)；中等紫罗兰色(4)；深紫罗兰色(5)，表达状态1和2(1个代码差异)的品种比表达状态为2和5(3个代码差异)的品种差异更大(图3B)。

图3 箭筈豌豆(A)种子蓝黑色形状和(B)花色的表达状态分级Fig.3 The expression state of (A) seed blue-black ornamentation and (B) color of standard flower in common vetch

2.5.2一致性判定 箭筈豌豆一致性判定的样本量分为：A样本量为100个植株或100个植株的100个部位；B样本量为200个植株。箭筈豌豆为自花授粉植物，品种内变异很小，变异主要来自于环境条件的影响，通常采用“异型株法”判定，用1%总体标准和 95%接收概率来确定异型株的数量。在样本量为200个植株的情况下，异型株的最大允许值为5，样本量大小为100个植株或100个植株部位情况下，最大允许值为3个异型株。对于“A” 样本量，先观测20个植株或20个植株的部位，如果没有发现异型株，表明该品种符合一致性。如果异型株>3个，则表明品种不一致。如果观测到1～3个异型株，则必须观测到80个植株或80个植株的部位。

2.5.3稳定性 在实际操作中，通常不单独进行稳定性测试，如果一个品种具备一致性，认为该品种具备稳定性。如特殊情况或存在疑问时，可通过种植该品种的下一代种子，与以前提供的繁殖材料相比，若性状表达无明显变化，则可判定该品种具备稳定性。

3 讨论

截止2019年4月，UPOV和欧盟植物品种局(Community Plant Variety Office, CPVO)已分别为325和192个植物属和种制定了DUS测试指南，DUS测试指南的公布数量整体呈现不断增加的趋势(图4)。同期，我国已公布了189项DUS测试指南，其中包括4个豆科牧草的DUS测试指南，分别为苜蓿(Medicagosativa；NY/T 2747-2015)[13]、柱花草属(Stylosanthes；NY/T 3434-2019)[21]、白三叶(Trifoliumrepens；NY/T 2565-2014)[22]和红三叶(Trifoliumpretense；NY/T 2480-2013)[23]，其中苜蓿共有21个基本性状和4个选测性状；柱花草有24个基本性状和3个选测性状；白三叶有31个基本性状；红三叶有30个基本性状。以上物种均为多年生豆科牧草，其中部分性状的观测在播种当年观测，部分在建植第二年进行观测。除柱花草外，剩余3种豆科牧草为异花授粉植物，在种群内具有更大的变异水平。本研究共评价了31个测试性状，箭筈豌豆作为一年生自花授粉豆科牧草，由于长期高度自交繁殖，个体基因型纯合度高，所有性状的观测结果均可在一个完整的生长周期中获得，而且相较上述多年生豆科牧草具有更多的观测性状。苜蓿、柱花草、白三叶和红三叶的DUS测试性状主要集中于营养器官(叶片等)，而在箭筈豌豆的31个测试性状中，有8个性状与种子相关，表明箭筈豌豆种子在不同品种间具有更丰富的遗传多样性。在苜蓿和柱花草的选测性状中涉及了抗性(抗病性和抗逆性)指标，箭筈豌豆被认为是一种抗寒作物，可以在冬季温和的地区生长[24]，因此在后续的研究中应考虑增加耐寒、耐盐、耐旱和抗炭疽病等选测性状。

图4 UPOV和CPVO不同年份DUS测试指南公布数量统计(数据整理自UPOV和CPVO官网)Fig.4 The number of DUS test guidelines developed by UPOV and CPVO (The data obtained from the official website of the UPOV and CPVO)

UPOV箭筈豌豆DUS测试性状中，部分性状的表达状态未能找到对应的参照品种，此外，部分性状的表达状态不能够将本研究收集的箭筈豌豆品种的性状准确描述。本研究对UPOV箭筈豌豆的23个测试性状有新的补充和修订，同时新增了8个具有DUS测试潜力的性状，并为31性状的所对应的表达状态找到了参照品种。此外，在31个测试性状中，22个性状是受环境因素影响较大的、多基因控制的数量性状。因此在测试箭筈豌豆品种时，在栽培管理上需要严格控制环境条件。同时测试人员的实测经验也很重要，因此测试人员需要经过专业培训，以保证对测试性状做出准确判定。随着箭筈豌豆品种选育工作的进一步开展，可能需要对本研究结果做进一步的修订，所以在实际测试中不局限本研究中筛选确定的性状和参照品种。如果测试品种与参照品种间存在特异性，但是性状表中的性状又不包含这些性状，可根据UPOV TG/1/3文件对“未列出性状”的要求增加性状描述，以满足箭筈豌豆DUS测试的需求。

4 结论

为了能够与UPOV接轨并达到国际水平，本试验主要以TG/32/7、TG/1/3及其相关系列文件为总体原则，同时结合我国箭筈豌豆育种现状和前期研究的基础上，对我国箭筈豌豆DUS测试的核心内容进行研究，共确定了32个参照品种和31个DUS测试性状，并对UPOV箭筈豌豆DUS测试指南中的部分性状表达状态的分级进行了补充。可为我国箭筈豌豆新品种 DUS 测试指南的形成提供基础，进而加速我国箭筈豌豆品种的保护、审定、登记和育种进程。