普境安对类似非洲猪瘟病毒的高接触性传染病病毒杀灭效果评估

2019-11-16

猪业科学 2019年9期

普境安说明：“普境安”主要成分为磷酸盐化合物（85%）、钙、铁、硫酸盐（2.6%）、活性氯、Perica 油（0.05%）和铝硅酸盐（10.1%）。“普境安”具有很强地降低病毒滴度，还可以降低大量细菌作用。减少微生物吸附造成的对表面微生物污染的作用，吸附地板上的水和尿素，减少氮排放，稍微的防臭作用使“普境安”适合用作很好的卫生材料。

评价目的：伪狂犬病病毒和禽痘病毒与非洲猪瘟病毒的分子结构相似，都是双股DNA 病毒，并且同是高接触性传染病，评价“普境安”体外降低伪狂犬病病毒、禽痘病毒活性效果的同时也为“普境安”降低非洲猪瘟病毒的活性提供有力依据。

评价方法：将“普境安”消毒剂设置梯度使用剂量（1/2 推荐剂量、推荐剂量、2×推荐剂量）在不同温度（4 ℃、16 ℃、37 ℃）、不同时间（5 min、15 min、30 min、45 min）、不同环境和伪狂犬病病毒（PRV）、禽痘病毒（FPV）分别作用后测病毒TCID50，抽提核酸后用荧光定量PCR 方法检测病毒核酸含量，观察“普境安”对伪狂犬病病毒和禽痘病毒的吸附效果。模拟消毒剂使用的现场环境（土壤、水泥地、粪便）和伪狂犬病病毒、禽痘病毒分别混合后再使用“普境安”干粉消毒剂作用，分别设置3 个变量（剂量、温度、时间）检测不同情况下“普境安”干粉消毒剂吸附病毒、降低病毒活性的作用。

本试验于2019年6 月在四川农业大学动物医学院动物生物技术中心完成

1 主要试剂及实验动物

1.1 毒株

猪伪狂犬病病毒（PRV-XJ），保存于四川农业大学动物生物技术中心；禽痘病毒毒株，保存于四川农业大学动物生物技术中心。

1.2 主要试剂

胎牛血清、细胞培养液（DMEM 培养液）、胰蛋白酶、PBS缓冲液、PK-15 细胞，鸡胚成纤维细胞，荧光PCR 引物，均由实验室提供；“普境安”消毒剂由丹麦（Stormøllen 公司）、成都杰鑫玛生物科技有限公司生产提供。

2 消毒剂安全评估结果

2.1 伪狂犬病病毒和禽痘病毒滴度测定

2.1.1 病毒液制备

将伪狂犬病病毒液和禽痘病毒液按常规操作分别接种于生长良好的PK15 细胞和鸡胚成纤维细胞，37 ℃、5% CO2条件下培养，当病毒发生70%～80%感染时，将病毒液反复冻融 2 ～3 次，收集病毒液离心取上清，分装于2 mL EP 管中。

2.1.2 测定伪狂犬病病毒和禽痘病毒的 TCID50

取上述制备好的病毒悬液用无血清的DMEM 细胞培养液进行10系列的稀释（10-1～10-10），分别接种于长满单层PK-15 细胞和鸡胚成纤维细胞的96 孔培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100 µL 的病毒悬液；用含2% PBS的DMEM 细胞培养液作为对照，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养，观察细胞有无细胞病变（CPE）变化并记录结果。按Reed-Muench 法计算病毒的TCID50。

2.1.3 伪狂犬病病毒和禽痘病毒滴度测定结果

病毒灭活滴度用半数细胞感染剂量（TCID50）表示。计算公式如下：

TCID50对数值=病变率高于 50%组稀释度的对数值+距离比例（“病变率高于 50%组”是指病变率超过 50%的最低组，下面均简称“高于 50%组”；“病变率低于 50%组”是指病变率低于 50%的最高组，下面均简称“低于50%组”）。

表1 伪狂犬病毒滴度测定结果

表 2 禽痘病毒滴度测定结果

根据表1 和表2 中结果，按Reed-Muend 法计算出伪狂犬病病毒的TCID50值为10-8.21/0.1 mL ,禽痘病毒的TCID50值为10-6.73/0.025 mL。

2.2 “普境安”消毒剂接触时间对禽痘病毒和伪狂犬病病毒体外杀灭效果测试

取288 个无菌培养皿，一半培养皿（108 个试验组+36 个对照组）涂1 mL 禽痘病毒液，另一半培养皿（108 个试验组＋36 个对照组）涂1 mL 伪狂犬病病毒液后放于 37℃无菌恒温箱干燥。向已干燥的病毒培养皿中以 25 g/m2，50 g/m2，100g/m2剂量加入粉剂“普境安”，在 4℃、16℃、37℃条件下使消毒剂单独与等份的病毒保持接触5 min，15 min，30 min，45 min（试验组每组设置3 组重复，最后取平均值，不同温度下不同时间设置空白对照组无消毒剂作用也做3 组重复）。后将“普境安”干粉移除，用1 mL DMEM 细胞培养液重悬收集培养皿中的病毒，做梯度稀释后测定试验组与对照组的TCID50对比病毒滴度的差异。

试验结果表明（见表3），“普境安”粉状消毒剂受温度的影响较小，在不同的浓度和环境温度下对病毒均有很好的杀灭作用，在接触15 min 后滴度减少平均达到4 以上，在作用30 min 后滴度减少平均达到5 以上，但在推荐剂量时杀灭效果最佳。

2.3 荧光定量检测“普境安”对禽痘病毒和伪狂犬病病毒体吸附效果

取288 个无菌培养皿，一半培养皿（108 个试验组＋36 个对照组）涂1 mL 禽痘病毒液，另一半培养皿（108 个试验组+36 个对照组）涂1 mL 伪狂犬病病毒液后放于37 ℃无菌恒温箱干燥。向已干燥的病毒培养皿中以 25 g/m2，50 g/m2，100g/m2剂量加入粉剂“普境安”，在4 ℃、16 ℃、37 ℃条件下使消毒剂单独与等份的病毒保持接触 5 min，15 min，30 min，45 min（试验组每组设置3 组重复，最后取平均值，不同温度下不同时间设置空白对照组无消毒剂作用也做3 组重复）。后将“普境安”干粉移除，用1 mL DMEM 细胞培养液重新悬浮收集培养皿中的干燥病毒，抽提病毒DNA，检测DNA 浓度。梯度稀释的标准品（即病毒原液）及待测样品进行实时定量PCR检测，用标准品制作标准曲线，检测对照组和试验组病毒核酸含量，对比差异。

试验结果表明（见表4），“普境安”粉状消毒剂可在不同温度和浓度下均可有效吸附环境中的病毒，在移除普境安粉末的同时能移除大量病毒，其受温度影响较小，推荐剂量在接触15min 以上能大幅降低病毒量，达到较好的清除效果。

2.4 “普境安”消毒剂在土壤环境中对病毒的吸附效果

试验设置 A、B 组，每组3个重复，A 为伪狂犬病病毒组：5×5×5 cm3的土壤中加 2 mL 伪狂犬病病毒原液；B 为禽痘病毒组：5×5×5 cm3的土壤中加 2 mL 禽痘病毒原液，同样在不同温度不同时间下设置空白对照组无消毒剂作用也做3 组重复。每组分别设置4 ℃、16 ℃、37 ℃3 个温度梯度，每个温度下以 25 g/m2，50 g/m2，100 g/m2的量加入粉剂“普境安”，作用 5 min、15 min、30 min、45 min 后用生理盐水将土壤溶解，4 000 r/min 离心5 min 取上清，然后将上清做梯度稀释检测病毒滴度，对比消毒剂处理前后病毒滴度的差异。

表 3 “普境安”对禽痘病毒和伪狂犬病毒作用后TCID50 结果

表 4 “普境安”对禽痘病毒和伪狂犬病病毒作用后荧光定量试验结果

试验结果表明（见表5），在土壤环境中，“普境安”粉状消毒剂在不同温度差异较小，在不同的浓度和环境温度下对病毒均有很好的杀灭作用，在接触5 min 后大幅度降低病毒滴度，在接触15 min 后病毒滴度平均降低4 以上。

2.5 “普境安”消毒剂对粪便环境中病毒的吸附效果

试验设置 A、B 组，每组3个重复，A 为伪狂犬病病毒组：5×5×5 cm3粪便加 2 mL PRV病毒原液；B 为禽痘病毒组：5×5×5 cm3粪便加2 mL FPV 病毒原液，同样在不同温度不同时间下设置空白对照组无消毒剂作用也做3 组重复。每组分别设置 4 ℃、16 ℃、37 ℃3 个温度梯度，每个温度下以25 g/m2，50 g/m2，100 g/m2的量加入粉剂“普境安”，作用5 min、15 min、30 min、45 min 后用生理盐水将土壤溶解，4 000 r/min 离心5 min 取上清，然后将上清做梯度稀释检测病毒滴度，对比消毒剂处理前后病毒滴度的差异。

试验结果表明（见表6），在粪便环境中，“普境安”粉状消毒剂在不同温度差异较小，在不同的浓度和环境温度下对病毒均有很好的杀灭作用，在接触15 min 后病毒滴度平均降低4 以上。

表 5 土壤环境试验 TCID50 结果

表 6 粪便环境试验 TCID50 结果

2.6 “普境安”消毒剂对水泥地面环境中病毒的吸附效果

试验设置A、B 组，每组3个重复，A 为伪狂犬病病毒组：100 cm2的水泥地面上加 2 mL PRV病毒原液；B 为禽痘病毒组：100 cm2的水泥地面加2 mL FPV 病毒原液，同样在不同温度不同时间下设置空白对照组无消毒剂作用也做3 组重复。待病毒液干后，每组分别设置4 ℃、16 ℃、37 ℃3 个温度梯度，每个温度下以25 g/m2，50 g/m2，100 g/m2的量加入粉剂“普境安”，作用5 min、15 min、30min、45 min 后移除“普境安”，用生理盐水冲洗地面后将其收集。然后做梯度稀释检测病毒滴度，对比消毒剂处理前后病毒滴度的差异。

试验结果表明（见表7），在水泥地面环境中，“普境安”粉状消毒剂在不同温度差异较小，在不同的浓度和环境温度下对病毒均有很好的杀灭作用，在接触15min 后病毒滴度平均降低4 以上。