凝血酶激活纤溶抑制物基因CPB2单核苷酸多态性与不明原因复发性流产的关系

李晓庆 徐晓敏

正常生理性高凝状态下的凝血-纤溶系统精确调控对正常的胚胎植入和滋养层细胞侵袭具有重要作用，而凝血机制异常可能是导致不明原因复发性流产（unex原plained recurrent spontaneous abortion，URSA）的原因之一[1-2]。有研究表明，血液凝血酶激活纤溶抑制物（thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor,TAFI）水平与早期URSA的发生呈负相关，高水平TAFI可降低早期URSA发生的风险[3-4]。TAFI是由羧肽酶B2（carboxypep原tidase B2，CPB2）基因编码并调控凝血-纤溶平衡的羧肽酶原，其功能主要为：（1）TAFI被凝血酶、凝血酶-血栓调节蛋白复合体或纤溶酶激活后，降解纤维蛋白C端赖氨酸残基以抑制纤溶酶介导的纤溶系统[1，3]；（2）血小板聚集后，血小板源性TAFI在血栓内部发挥抗纤溶作用[5]；（3）激活后的TAFI可抑制纤溶和凝血系统引起的下游免疫反应，并抑制胎盘滋养细胞凋亡[6]。目前，已有的CPB2单核苷酸多态性（single nucleotide polymor原phisms，SNPs）检测研究结果显示，位点如 rs2146881（-438G＞A）、rs3742264（505A＞G）和 rs1926447（1040C＞T）与血浆TAFI水平和纤溶活性相关，且在URSA患者和正常人群中的分布具有显著差异[7-9]。本研究对温州地区女性人群中URSA患者及正常妊娠者TAFI编码基因CPB2SNPs进行基因型分析，探讨CPB2SNPs与URSA的关系。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2015年1月至2016年12月在温州市人民医院就诊并诊断为URSA的96例患者作为URSA组。纳入标准：（1）夫妇双方均为温州地区人，既往体健，无家族遗传病史；（2）女方为生育期妇女，常规行超声、内分泌、抗卵磷脂抗体、抗子宫内膜抗体、染色体、传染病检查结果均正常，符合URSA诊断标准[10]；（3）男方精液常规、DNA碎片分析及传染病检查结果均正常。另以103例同期在我院健康体检的女性作为对照组。纳入标准：（1）夫妇双方均为温州地区人，既往体健，无家族遗传病史；（2）女方为生育期妇女，成功分娩一胎以上，无自然流产史，常规行超声、内分泌、抗卵磷脂抗体、抗子宫内膜抗体、染色体、传染病检查结果均正常；（3）男方无传染性疾病。排除两组蛋白C、蛋白S、抗凝血酶芋水平异常，以及已知血栓相关SNPs位点、凝血因子吁 G1691A Leiden、凝血因子域 G20210 A和MTHFR C677T突变。随访并记录患者纤维蛋白原（FIB）、D-D二聚体（D-Dimer）和血小板最大聚集率（PAgT）中 PAgT（ADP）、PAgT（AA）水平。本研究经温州市人民医院伦理委员会同意，受试者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 一般资料比较 收集两组对象的一般资料并进行比较，包括年龄、BMI、妊娠史、流产史，以及有无孕期乙肝病毒携带、子宫肌瘤、瘢痕子宫、甲状腺功能减退症、癫痫、心血管系统疾病、胆道系统疾病史。

1.2.2 基因组DNA提取 抽取外周静脉血2ml，采用血液基因组DNA提取试剂盒（德国凯杰公司）提取全血DNA，保存于-80益。

1.2.3 URSA相关基因目标区域捕获和测序 目标捕获芯片设计及测序由深圳华大基因科技服务有限公司完成。去除接头污染和低质量数据后，采用SAMtools（http://samtools.sourceforge.net/）、GenomeAnalysisTK（https://software.broadin stitute.org/gatk/）分析样本突变位点，筛选基因分型率＞90%且位点覆盖度＞10reads为可信SNPs位点。通过 dbSNP（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）和 HapMap数据库（http://www.internation原algenome.org/category/hapmap）对位点注释，并采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对SNPs位点进行验证。探针设计及位点检测由深圳华大基因科技服务有限公司MassARRAY平台完成。

1.3 统计学处理 采用SPSS 21.0统计软件。计量资料用表示，组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用x2检验，1＜理论频数（T）＜5时采用连续性校正的x2检验，T＜1时采用Fisher确切概率法检验。Hardy-Weinberg平衡定律吻合度检验、两组基因型和等位基因频率分布比较均采用x2检验；关联分析采用95%可信区间（CI）的比值比（OR）表示，并采用 B onferroni法和FDR法对结果进行多重检验校正。URSA患者不同CPB2SNPs 基因型间 FIB、D-Dimer、PAgT（ADP）和PAgT（AA）差异比较采用Mann-WhitneyU秩和检验。检验水准设为琢=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 两组间除妊娠次数和流产次数外，其他一般资料的差异均无统计学意义（均P＞0.05），详见表1。部分混杂因素在两组中无分布。

表1 两组一般资料的比较

2.2 CPB2 SNPs基因型和等位基因频率分布 6个已知SNPs位点（rs2296642、rs3742264、rs7337140、rs9316179、rs2277440、rs1926447）在两组中存在多态性且分布符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。URSA组rs2296642（检验效能为0.649）等位基因C、rs3742264（检验效能为0.873）等位基因 A、rs7337140（检验效能为 0.630）等位基因G和rs9316179（检验效能为0.844）等位基因C频率分别低于对照组。经Bonferroni法和FDR法多重检验校正，rs3742264和rs9316179等位基因和基因型频率分布两组间的差异均有统计学意义（均P＜0.05），详见表2。

表2 URSA组与对照组CPB2 SNPs基因型/等位基因分布

2.3 CPB2 SNPs连锁不平衡分析 rs2296642-rs7337140（D忆=0.91，r2=0.83）和 rs3742264-rs9316179（D忆=1，r2=0.98）为强连锁不平衡（D忆＞0.9，r2＞0.33）。URSA 组基因型组合rs3742264-rs9316179:GGTT频率显著高于正常组（61.5% vs 39.8%，OR=2.411，95%CI：1.364-4.263，x2=9.318，校正后P＜0.05），详见表 3。

表3 URSA组与对照组CPB2 SNPs连锁基因型组合分析

2.4 URSA组CPB2SNPs不同基因型间血栓指标差异分析 rs3742264 GG携带者PAgT（ADP）水平为78.0（72.8～83.6）%，分别低于rs3742264 GA和AA携带者的 81.7（76.5～86.8）%和 82.65（78.80～86.50）%，携带一个或两个A等位基因与非携带者PAgT（ADP）水平差异有统计学意义（P=0.037）（图1）。rs3742264不同基因型间FIB、D-Dimer和PAgT（AA）的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。其他SNPs不同基因型间FIB、D-Dimer、PAgT（ADP）和PAgT（AA）的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

图1 URSA组不同rs3742264基因型患者PAgT（ADP）水平的比较

3 讨论

正常妊娠过程引起的生理性高凝状态将增加血栓形成风险，在这一状态下的凝血机制异常引起的胎盘微血栓和胎盘功能障碍可导致URSA，而TAFI对局部凝血-纤溶系统精确调控至关重要[1，9]。在血栓调节蛋白的活化作用下，TAFI介导的纤溶抑制和蛋白C介导的凝血抑制可精确调控凝血功能，并共同抑制血栓导致的下游炎症反应，且TAFI的纤溶抑制调控仅作用于局部，对血栓外的正常凝血功能无显著影响[6，11]。Knol等[3]和Legnani等[4]分别对荷兰与意大利URSA与血浆TAFI相关性分析表明，早期URSA患者中TAFI水平显著低于正常人群，指出高浓度TAFI可降低URSA发病风险。ElDanasori等[9]对早期妊娠人群TAFI功能研究发现，除调控妊娠期凝血-纤溶平衡外，低纤溶状态下的高浓度水平TAFI可抑制纤维蛋白降解产物的形成，减少胎盘滋养细胞的凋亡，有利于正常妊娠，尤其是早期妊娠。目前，较多CPB2基因突变位点及多态性位点已被证明与TAFI活化、催化活性、失活及血栓疾病发生等密切相关[6-8]。

本研究采取严格的选取标准，采用目标序列捕获测序方法和飞行质谱法，对温州地区人群中96例URSA女性和103例正常妊娠史女性CPB2基因测序分析表明，rs3742264和rs9316179等位基因和基因型频率分布在两组间差异显著（Bonferroni＜0.05，FDR＜0.05），rs3742264 A（OR=0.490）和 rs9316179 C（OR=0.506）与URSA的发生呈负相关，具有保护作用。携带rs3742264-rs9316179 GGTT（OR=2.411）女性URSA发病风险显著高于正常女性。其中，rs3742264（505G＞A）导致Ala147Thr错义突变，rs9316179（678T＞C）为同义突变（SIFT和Polyphen2预测为良性突变），rs3742264和rs9316179为强连锁不平衡（D忆＞0.9，r2＞0.33），因此，我们认为强连锁导致rs9316179在两组分布差异，而rs9316179并不具有临床效应。Arauz等[12]发现CPB2基因多态性的改变能够机体的凝血和纤溶状态，人体内TAFI的水平与基因多态性有紧密的联系。Santos等[13]和Wang等[14]对血栓患者的研究表明，rs3742264（505G＞A）与血浆TAFI水平具有显著相关性，携带rs3742264等位基因A人群TAFI水平显著高于携带G位点人群。而Masini等[7]对意大利URSA人群CPB2基因的5个高TAFI水平相关SNPs位点检测发现，505G＞A和1583A＞T与URSA的发生呈负相关，携带rs3742264等位基因A可显著提高血浆TAFI水平，并降低URSA发病率。而我们分析rs3742264与URSA患者血栓相关指标发现，rs3742264 GG患者PAgT（ADP）水平显著低于rs3742264 GA和AA患者。外周血TAFI分为血浆源性TAFI和血小板源性TAFI。Urano等[5]对血小板源性TAFI功能的综述提示，血小板源性TAFI可促进血小板聚集并在血栓内部迅速积聚以抑制血栓溶解。而Dempsey等[15]分析复发性流产患者4-7周的血小板功能后指出，再次妊娠失败的URSA患者PAgT（ADP）水平显著低于再次妊娠成功的URSA患者。据此，我们猜测rs3742264等位基因A可维持正常血浆TAFI水平和血小板功能，有利于正常妊娠。

综上所述，我们对温州地区URSA女性CPB2基因的SNPs分析发现，TAFI与URSA具有相关性。但由于本研究样本量较小（部分位点检验效能小于0.8），一方面需要加大样本量对实验结果进行验证，另一方面需要检测突变基因携带人群TAFI水平，观察基因突变是否影响TAFI抗纤溶功能，从而为温州地区临床URSA治疗提供可靠依据。