γ-干扰素酶联免疫斑点法联合结核菌素试验在附睾结核诊断中的应用价值

刘建华, 崔振鹏, 张礼军, 李军孝, 陈其亮

(1. 陕西省结核病防治院, 陕西 西安, 710100; 2. 兵器工业五二一医院, 陕西 西安, 710065;3. 湖北民族大学附属民大医院, 湖北 恩施, 445000)

附睾结核是目前临床上最常见的男性生殖系统结核，附睾结核的主要后遗症是附睾管和近端输精管不完全或完全梗阻，可表现为少精或无精等症状，进而导致不育，严重影响患者的生活质量[1-3]。附睾结核的诊断一般无太大困难，若有典型的附睾硬结及串珠样输精管病变，即可做出诊断[4]。但早期和急性发作的附睾结核易误诊，与慢性附睾炎急性发作等非结核性疾病难以鉴别，影响附睾结核的早期治疗[5]。γ-干扰素(IFN-γ)酶联免疫斑点法(ELISPOT)联合结核菌素试验是一种全新的结核诊断方法。本研究探讨IFN-γ酶联免疫斑点法联合结核菌素试验在附睾结核诊断中的应用价值，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究获得全体患者的知情同意，并被本院的伦理委员会批准认可。实验操作前要求患者签署知情同意书，完善相关资料。纳入标准: ① 能配合检查者; ② 经手术病理证实附睾结核患者; ③ 无严重肝、肾功能障碍者; ④ 知情同意者; ⑤ 可长期随访者。排除标准: ① 患者精神状态欠佳，不能配合相关工作; ② 生殖器畸形; ③ 意识或精神障碍。共选取经手术治疗且病理结果证实为附睾结核患者90例，年龄22～41岁，平均(29.10±12.40)岁; 病程1～4年，平均为(3.40±1.10)年。根据诊断方法将患者分为A组(酶联免疫斑点法)、B组(结核菌素试验)、C组(IFN-γ酶联免疫斑点法联合结核菌素试验)，每组30例。3组患者的年龄、病程等一般资料比较无显著差异(P>0.05), 具有可比性。

1.2 方法

ELISPOT试剂由深圳市达科为生物技术有限公司提供，为国产试剂。纯蛋白衍生物(PPD)由成都生物制品研究所提供。A组行IFN-γ酶联免疫斑点法: 采集10 mL静脉血，使用乙二胺四乙酸(EDTAK2)抗凝, 2 h以内将采集的血液标本常规分离单个核细胞(PBMC), 共洗涤2次，在ELISPOT培养板中预包被抗-IFN-γ抗体，板中每个孔加入100 μL的细胞悬液，每孔的细胞数大约为2.0×105。于阳性对照孔内每孔加入植物血凝素(PHA), 浓度为5 μg/mL, 于阴性对照孔的各孔中，拒绝添加刺激物。在实验孔中分别加入终浓度均5 μg/mL的特异性抗原刺激物: PoolB、ESAT-6﹑PoolA。将培养板置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养16～24 h。2 h后洗板，加入生物素化的抗IFN-γ, 温育1 h。继续使用亲和素标记二抗后持续孵育1 h, 加底物液显色。待显色洗板后，使用自来水终止反应，在显微镜下或用ELISPOT测定仪计斑点数，记录分析斑点的数量。

B组行结核菌素试验法: 采用皮内注射法。配皮试液: 先吸PPD原液0.1 mL备用，另吸PPD原液0.2 mL, 加0.9%氯化钠注射液稀释至0.4 mL备用。PPD的用量: 第1次试验液为每0.1 mL中含有0.000 1 mg。OT一般首次使用1∶10万倍稀释液。常规消毒后在患者上肢前臂行皮内注射 0.1 mL标准PPD(20个国际结素单位/mL)。2～3 d后观察并记录实验结果，注意局部有无硬结，不可单独以红晕为标准。记录硬结直径，取平均值。C组行IFN-γ酶联免疫斑点法联合结核菌素试验。各组患者均行常规的检查及相关化验(血生化检查、心电图、血尿便常规、静脉肾盂造影、阴囊彩超、胸部正位片、肝胆脾胰肾彩超)。

1.3 观察指标

ELISPOT检测结果: 结果判定参照国产ELISPOT试剂的阈值标准，据斑点数量设定，每孔中斑点数目排除阴性孔中的斑点数则为检测的结果，斑点数量≥30为阳性结果，若Poo lB、ESAT-6、Poo lA这3种抗原中至少有1种抗原的检测结果是阳性，结果判为阳性; 若3种抗原的测试结果都显示阴性，结果判定为阴性。

PPD试验检测结果: 判定采用中国的通用标准。测量PPD局部反应出现的红肿硬结的横径和纵径，取平均值，依据硬结的平均直径判断结果: 直径≥5 mm为阳性, <5 mm则为阴性。

1.4 统计学分析

应用统计学软件SPSS 13.0处理数据，计数资料采用百分率(%)表示。两组间比较采用χ2检验，计量资料采用均数±标准差表示。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

C组附睾结核诊断阳性率高于A组、B组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 3组诊断附睾结核阳性率比较

与C组比较, *P<0.05。

3 讨 论

附睾结核疾病发展一般较为缓慢，附睾逐渐肿大，无明显疼痛，多见于中青年男性，因附睾结核早期的症状隐匿，病程缓慢，未受到患者的足够重视，以至于不能及时采取有效的治疗措施[6]。患者多因疾病发展至后期引起其他脏器结核，导致双侧附睾切除，丧失自然生育能力。若能在疾病早期提高对附睾结核的诊断阳性率，特别是不典型病例的早期诊断，则能有效提高患者的生活质量[7-10]。IFN-γ酶联免疫斑点法和结核菌素试验能对附睾结核的早期诊断提供一定的依据[11-13]。

本研究采用的ELISPOT既可对分泌不同细胞因子的人体细胞进行检测，还能够检测产生不同类型抗体的B细胞及释放抗原的细胞，同时操作上具有简便、可重复的特性，可以对治疗前后的2种标本进行平行测试，检测结果重复可行，可进行回顾性和前瞻性研究，新鲜与冷冻的标本检测结果基本相同。这种诊断附睾结核的检测方法，根据临床经验及相关研究[14-15]证实，相对于传统的ELISA检测和细胞内染色效果更敏感，结果更明确，被广泛应用于临床检测结核操作。因检查对结核具有高敏感性、高特异性等特点，并可以排除卡介苗干扰，所以部分学者将其视为结核菌素皮试的“升级版”，成为目前特异性最高的检测结核的方法。本研究中, ELISPOT检查结果为阳性23例(73.33%), 与病理结果大致相符。

本研究中，将患者血液细胞分泌产生的细胞因子使用抗体捕获并培养，继而采用酶联斑点显色的操作方式将其表现出来，原理为特异性抗原刺激T淋巴细胞后，产生细胞因子，包被于膜的特异单克隆抗体捕获细胞因子，被捕获的细胞因子先与生物素标记的二抗结合，继而与碱性磷酸酶标记的亲和素结合，由BCIP/NBT底物现色后，细胞若产生细胞因子将会在孔底出现紫色斑点。此检测方法在附睾结核的诊断阳性率较高，但仍然在早期诊断中存不足: ELISPOT对条件要求严格，结果容易导致偏差，且在抗原刺激及细胞培养过程中，如有细菌污染实验，则将导致检测结果不准，实验失败，且操作流程要求严格，实验材料费用较高，不宜二次操作[15-16]。本实验通过将IFN-γ酶联免疫斑点法和结核菌素试验两种方法联合检测，弥补检验操作上的不足，提高附睾结核早期诊断的阳性率。

结核菌素试验对患者附睾结核病的早期诊断和鉴别有重要作用，是临床上较为重要的辅助检查方法。本研究中，通过皮内注射结核菌素，依据患者注射部位的皮肤硬结反应结果诊断由结核杆菌感染所致Ⅳ型超敏反应的附睾结核。本研究中，单独采用PPD 检测附睾结核的阳性率仅有70.00%，原因可能为结核菌素是结核杆菌的菌体成分，包括旧结核菌素(OT)和PPD。附睾结核的致病菌为结核杆菌，PPD 原理是科赫现象，其抗原是由 200 多种蛋白组成的结核杆菌培养物过滤液粗提的浓缩物，很多成分与卡介苗(BCG)及非结核分枝杆菌(NTM)相同，故PPD对众多成分如BCG及 NTM 在内等较敏感。中国儿童出生时常规行卡介苗接种，导致结果假阳性率较高，严重影响临床对早期结核的诊断。因此该试验对诊断附睾结核病仅具有参考意义，但不能对附睾结核的早期诊断给出确诊的依据[17-18]。

本研究将酶联免疫斑点法与结核菌素试验联合应用，附睾结核诊断有效率可达93.33%, 表明2种方法相结合有极好的敏感性与特异性。根据统计学分析显示，各组存在差异，说明IFN-γ酶联免疫斑点法联合结核菌素试验优于单纯应用酶联免疫斑点法检查及结核菌素试验，其在附睾结核的早期诊断及鉴别诊断中有一定的临床意义。