固原地区鸡输卵管炎病原菌的分离鉴定及药敏试验

安慧慧

（固原市原州区动物疾病预防控制中心，宁夏 固原 756000）

产蛋鸡输卵管炎是蛋鸡常见的繁殖障碍疾病，主要经呼吸道、消化道感染,临床上主要表现为蛋鸡无产蛋高峰,产畸形蛋、软壳蛋、血丝蛋和薄壳蛋等[1]，引起输卵管炎的原因主要是因为鸡舍卫生条件太差，泄殖腔被细菌（如白痢沙门氏菌、大肠杆菌等）污染而侵入输卵管导致鸡死于输卵管炎和腹膜炎。近几年，随着养鸡业的不断发展，饲养规模的扩大，禽大肠杆菌病已成为危害养鸡业的重要传染病之一。对该病进行有效的防控对养鸡业健康发展至关重要，而抗菌药物的合理与有效使用是控制与防治[2]该病的重要环节。

由于家禽养殖者不科学使用抗生素，导致大肠杆菌病耐药性不断增加，防治难度越来越大[3]，为了有效防治本病，必须定期了解其对各种抗菌药物的敏感程度，以指导临床抗菌药物的合理使用。本试验通过临床症状，尸体剖检初步诊断为慢性输卵管炎，经微生物学检查诊断为致病性大肠杆菌。同时对输卵管炎病例进行病原菌的分离鉴定，并用12种常用抗菌药物对分离出的致病性菌株做进一步的药物敏感性试验，筛选出比较敏感的药物，为临床防治鸡输卵管炎提供数据参考。

1 材料

1.1 试验病料及供试动物

在宁夏固原某养鸡场两栋鸡舍中采集病料，剖解检查7只有输卵管炎的病死鸡，无菌采集输卵管病料，标记清楚，放入37℃恒温箱中培养以备用，共采集病料7份。7日龄雏鸡32只。

1.2 主要仪器设备

XSP-3C生物显微镜（上海长方光学仪器有限公司）、DNP-9052电热恒温培养箱（上海鸿都电子科技有限公司）、DNG-9030电热恒温干燥箱（上海鸿都电子科技有限公司）、JP-500托盘天平（上海新诺仪器设备有限公司）、280A高压蒸汽灭菌锅（合肥华泰医疗设备有限公司）等设备。

1.3 试验试剂及药物

革兰氏染色液（ABCD）天津傲然精细化工研究所；麦康凯琼脂购自北京奥星生物技术有限公司；普通营养琼脂购自北京奥星生物技术有限公司；三糖铁琼脂购自北京三药科技开发公司；LB培养基购自北京奥星生物技术有限公司。葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、枸橼酸盐、M.R试剂、V-P试剂、硝酸盐试剂等。

链霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、氯霉素、土霉素、环丙沙星、卡那霉素、四环素、头孢哌肟、培氟沙星、庆大霉素、头孢哌酮，均购自上海伊华医学科技有限公司。

2 方法

2.1 培养基的制备

按成品营养琼脂、麦康凯、三糖铁、LB培养基的说明书正确称取原料，按照配方配置培养基。高压蒸汽灭菌20 min，将灭菌的营养琼脂，麦康凯培养基趁热倒入已灭菌好的培养皿中，每个皿中倒15～20 ml，将分装好的培养基放在无菌台上过夜，第二天包裹并做标记。将三糖铁趁热分装入试管，10～15 ml/支，完成时倾斜15～20°，第二天放于试管架上并标记。用吸管吸取LB溶液于小试管中，5 ml/支，放于试管架上并标记，将以上标记好的培养基放入4℃冰箱备用。

2.2 病原菌的分离提纯

将有细菌生长的LB液用接种环接种到营养琼脂培养基上，加盖标记，倒放于恒温箱37℃培养24 h后观察菌落生长情况，然后挑取营养琼脂上的单个菌落在营养琼脂上进一步纯化。

2.3 病原菌的鉴定

染色镜检：选择干净的载玻片，用移液器吸一滴生理盐水于载玻片上，用灭菌的接种棒挑营养琼脂纯培养基上单个菌落少许于生理盐水上，均匀涂布，自然干燥后用火焰固定，进行染色。吸取草酸铵结晶紫溶液进行染色，作用1～2 min水洗；吸取革兰氏碘溶液于抹片上媒染，作用1～3 min水洗；吸取95%酒精于抹片上脱色，约0.5～1 min水洗；吸取稀释的石炭酸复红染10～30 s水洗，染完后自然干燥，镜检。挑取分离纯化的单个菌落，进行革兰氏染色、镜检，观察其形态特征。

麦康凯培养基：将提纯的大肠杆菌单个菌落挑起，用灭菌的接种环挑取营养琼脂纯培养基上菌落接种到麦康凯培养基上，恒温箱37℃培养24 h后观察。

三糖铁培养基：将提纯的大肠杆菌接种在三糖铁琼脂斜面，恒温箱37℃培养24 h后观察。

2.4 生化试验

对分离菌株进行葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、M.R、V-P、枸橼酸盐、硝酸盐还原试验9项生化指标的测定。

2.5 致病力试验

将供试动物随机分成8组，把分离鉴定的菌株接种到LB培养基上，恒温箱37℃培养24 h。实验组以0.2 ml/只颈背部皮下注射LB有菌液，对照组4只注射相同剂量的灭菌生理盐水，隔离饲养，观察并记录发病情况。剖检病死雏鸡，观察其病理变化，并无菌采取死亡雏鸡的肝脏，接种麦康凯平板分离培养细菌、涂片、染色镜检、生化反应，鉴定是否与分离菌相同。

2.6 药敏试验

将鉴定为大肠杆菌的纯培养基上的单个菌落接种于LB培养基中，恒温箱37℃培养24 h。在无菌台上，取LB培养基摇匀，将LB中的有菌培养液用吸管吸取5 ml，均匀的散布在营养琼脂表面，将多余的有菌液吸取弃去。用镊子取药敏片贴到培养基表面，然后在培养基上划一个箭头，箭头所指的方向为开头，顺次贴药敏片，贴完后盖上盖子，做好相应的标记。将贴好药敏片的培养基倒放在恒温箱37℃培养24 h后观察，用直尺测抑菌圈的直径并记录（见表1）。

3 结果与分析

3.1 细菌培养特性

在LB培养基中呈均匀浑浊。营养琼脂上菌落呈圆形隆起、表面光滑、湿润、半透明、乳白色。麦康凯培养基上菌落呈圆形凸起，表面光滑、湿润、边缘整齐，粉红色。三糖铁培养基的斜面和底层均为黄色，底部有气泡产生。

表1 药敏片抑菌圈判断标准

3.2 细菌形态学检查

病料涂片镜检可见，被检菌为两端钝圆的阴性短杆菌，多数散在排列，偶有2～3个连在一起。纯培养物革兰氏染色镜检可见，培养物为革兰氏阴性中等大小的直杆菌，两端顿圆，单个或成对分布。通过纯培养，分离到大肠杆菌7株。

3.3 生化试验结果

生化试验结果如表2所示。

表2 生化试验结果

由表2可知，分离的7株细菌都能够发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖，产酸产气，对MR试验为阳性，V-P试验、枸橼酸盐利用试验均为阴性，硝酸盐还原实验为阳性。综合以上实验结果，可确定分离的7株菌为大肠杆菌。

3.4 致病力试验结果

接种12 h后出现精神沉郁，食欲减退，羽毛松乱等临床症状，接种24～48 h除2株分离菌未造成雏鸡死亡，其余5株分离菌均造成雏鸡大于2/3死亡，病死鸡剖检的病理变化、涂片、染色镜检、生化反应与上述分离菌相同，对照组正常生长，因此在7株分离菌中可确定5株为致病性菌株。

3.5 药敏试验结果

5株致病性大肠杆菌药敏试验结果如表3所示。

表3 5株致病性大肠杆菌对12种抗菌药物的耐药率

由表3可知：分离鉴定的5株致病性大肠杆菌中有4株对恩诺沙星敏感，敏感率达80%，有3株对卡那霉素和头孢吡肟敏感，敏感率为60%，对其余9种抗菌药物都有不同程度的耐药性，其中对氟苯尼考、四环素、土霉素的耐药率最高，达80%，其次是对链霉素、氯霉素、庆大霉素、头孢哌酮，耐药率达60%，对环丙沙星、培氟沙星的耐药率为20%。

4 讨论

引起鸡发生大肠杆菌病的因素众多，鸡群体内有潜在的致病性大肠杆菌[4]，或与其它病原合并感染，或继发于其它鸡病等。本试验所选养鸡场而言，引起鸡发生输卵管炎性大肠杆菌的主要原因是饲养管理不当，鸡舍内卫生状况较差，通风不良，氨气浓度高，消毒措施不严格，饲喂了发霉变质的饲料，鸡群受到强应激而导致机体抵抗力下降，环境中的大肠杆菌乘虚侵入鸡群体内引起大肠杆菌病的发生。为了降低鸡大肠杆菌病发病机率，应做好日常饲养管理工作。首先要制定严格的消毒措施；其次不能饲喂变质的饲料，饮水要清洁；做好鸡舍通风和保暖，保持鸡舍清洁干净[5]，降低鸡舍空气中氨气和粉尘含量，控制鸡群密度，减少应激；最后在临床用药方面要注意尽量避免长期大量使用同一种药物，以免产生耐药性，还应考虑采取联合用药、交叉或轮换用药等方法，才能有效防治大肠杆菌病。