4种鲤科鱼类线粒体atp6基因差异分析

郭元顺，王树峰，李生瑄，王静汝，董 鑫，李 洁

（甘肃农业大学 动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070）

武昌鱼、鲫鱼、草鱼和鲢鱼4种鲤科鱼类均为淡水鱼，分布广泛，且抗病力强、易饲养，肉质鲜美，营养丰富，是我国优良的主要淡水养殖鱼类。然而其遗传资源的研究和优良品种的培育却远落后于家畜家禽。环境污染导致的水生生态系统的严重破坏，许多水生生物已经或正在灭绝[1]。

鱼类的线粒体DNA(简称mtDNA)与核DNA相比，具有分子小、编码效率高、拷贝数多、结构简单、进化速度快、不同区域进化速度存在差异以及母性遗传等特点[2]。目前，随着DNA测序技术和分子信息学的快速发展，线粒体DNA作为遗传标记被越来越广泛地应用于群体遗传和系统进化的研究，生物的遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，也是种质资源保护和利用的前提和基础[3]。本研究对鲤科鱼类线粒体atp6基因（atp6基因是重要的线粒体功能基因[4]）序列进行测序并分析鲤科4个属间的系统发育关系,旨为今后的渔业资源研究提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

试验所使用的四种鲤科类鱼武昌鱼（WCY）、彩鲫(CJ)、草鱼(Cao)、鲢鱼(BL)各4条均采自于甘肃省临夏回族自治州永靖县刘家峡镇。采集新鲜的肌肉组织在-80℃保存备用。

1.1.1 选择的其他实验鱼类 鱼类信息见表1。

表 1 17种鱼类信息

1.2 主要仪器与试剂

高速低温离心机、微量移液器（0.1～2.5μl、0.5 ～ 10μl、10 ～ 100μl、20 ～ 200μl、100～1000μl）、梯度PCR扩增仪、微型旋涡混合仪（上海）、水平电泳仪、凝胶成像系统（法国VILBER凝胶成像系统）；DNA提取及PCR扩增相关试剂。

1.3 DNA的提取与检测

通过常规的酚-氯仿抽提法提取基因组总DNA（参照《分子克隆实验指南》提取基因组DNA）[5]，使用超微量分光光度计检测后于-20℃下保存。

1.4 引物设计

根据GenBank已经公布的草鱼线粒体全基因组序列（Genbank Number： HQ891005），使用Primer Premier 5.0软件设计引物。上游引物(atp6u)：5′ -AGC CCT GAG ACT GAC CAT G-3′，下游引物 (atp6d )： 5′ - GGC TAA TTG TTT CGA TAA T-3′,引物由天津金维智生物工程有限公司合成。

1.5 atp6部分序列PCR扩增及测定

采用50μL的PCR扩增体系：1μl基因组DNA，25μl TaqDNA聚合酶，上下游引物各0.5μl，加入灭菌水补足至50μL。

最适PCR扩增反应条件：94℃预变性3 min ；94℃变性20 s，51.5℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃ 延伸10 min；4℃保存。扩增产物经检测后由天津金维智生物工程有限公司测序。

1.6 数据处理

用Chromas version对测序结果进行编辑，人工校对；使用MEGA5.0软件进行比对并建立数据库，通过数据库建立系统发育树，同时确定A、T、G、C的含量与比例。最后用DANsp软件对核苷酸多样度、平均核苷酸差异度、保守度、单一信息位点、简单信息位点进行分析。

2 结果与分析

2.1 DNA提取结果分析

通过对浓度与OD值的测定（表2），说明浓度与OD值在正常范围内，可用所提取的DNA进行后续的PCR扩增（1.8≤OD≤2.1）。

表2 4种鲤科鱼类的DNA提取结果分析

表3 4种鲤科鱼类线粒体atp6基因与17种鱼类的差异性分析

2.2 引物退火温度筛选及PCR扩增结果分析

2.2.1 退火温度筛选 从图 1的检测图片种可以看出，引物的六个温度梯度下检测的电泳条带其中五个较亮，第二个温度51.5 ℃的条带完整并且光亮，所以选择了在51.5℃下进行4个鱼种mtDNA的atp6基因的部分片段进行PCR扩增。

图1 PCR扩增引物的退火温度筛选

2.2.2 PCR扩增结果 已知该引物片段大小为436 bp，利用2 000 bp marker做模板，预测结果与实验检测结果相一致。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,观察PCR扩增产物电泳图，在约500 bp处呈现1条特异性条带(图2)，与预期的片段大小吻合，且无非特异性条带，说明本研究设计的PCR引物及反应条件具有较好的特异性，符合目的基因。同时可以看到一条明亮的条带，说明PCR扩增成功，将所得到的PCR扩增产物进行编号，4℃保存。

图 2 4种鲤科鱼类线粒体atp6基因PCR扩增结果

2.3 测序结果分析

通过Chromas version软件对测序结果进行分析（图3），结果显示对于鲤形目的4种鱼所测定的序列波峰信号单一，无其他杂乱信号的干扰，测序结果可用于进行之后的序列分析。

图 3 4种鲤科鱼类线粒体atp6基因测序结果

2.4 12种鲤科鱼类atp6基因差异性对比结果分析

数据结果显示（表3），利用MEGA5.0程序对本研究中涉及到的12种鲤科鱼类的atp6基因序列进行单核甘酸多态性（SNP）分析，结果显示12种鲤科鱼类的atp6基因436bp的核苷酸序列中T、C、A和G平均含量分别为29%、28%、30%和13%。Dnasp程序分析显示：12种鲤科鱼类碱基变异数（S）分布及核苷酸多样度（Pi：序列间每个位点的平均核苷酸差异数）分析结果见图 4和图 5。在第1到第53个碱基之间和第380到第436个碱基之间均没有发现碱基变异，说明这是相对保守的两个区域，变异区在第53个碱基与380个碱基之间，第53与104个碱基之间发生变异的频率最高，均在40次以上。核苷酸多样度Pi变化趋势与碱基变异位置分布趋势整体上相似，在第1个到第53个碱基和第380到第436个碱基之间没有多样性可言，其余部分均存在不同程度的核苷酸变异，核苷酸多样度的最高值出现在第104个碱基左右。

图4 12个鲤科鱼种atp6基因序列碱基变异位置及分布频率

图5 12个鱼种atp6基因序列核苷酸多样度（Pi）

2.5 系统发育进化树分析

利用MEGA5.0软件，采用NJ (Neighborjoining)算法构建试验所用4种鲤形目鱼与GenBank中下载得到的17种其他鱼类（表 1）的系统进化树（图 6），结果表明该进化树将21种鱼大致分为了四个分支，试验中的12种鲤形目鱼，其中第一个分支中包含了11种鲤形目的鱼，亲缘关系为45；而鲤形目的胭脂鱼和灯笼鱼目的杂斑狗母鱼被分为第二分支，亲缘关系为52；在第三个分支中鲑形目的两种鱼和鲈形目的三种鱼亲缘关系为47;第四个分支中达氏深水尾魟与莫桑比克罗非鱼（AY597335）、罗非鱼（NC007231），亲缘关系较近为69。鲤形目的11种鱼与其余10种鱼的亲缘关系较远。

图6 4种鲤形目鱼类与其他17种鱼类的系统进化树（NJ法）

3 讨论

3.1 遗传多样性分析

遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，而核苷酸多样度是衡量群体遗传变异程度的重要指标[6]。核苷酸多样度越大，群体遗传变异程度越高[7]。分析线粒体基因组4种碱基百分含量可以发现鱼类粒体基因组的碱基组成与其他脊椎动物相同均具有A+T%碱基偏向性[8]。从遗传和进化角度看,一个物种的遗传多样性与其适应能力、生存能力和进化潜力等密切相关[9]。

分析线粒体基因组4种碱基百分含量可以发现，4种鲤科鱼类武昌鱼（又称团头鲂）、彩鲫、草鱼、鲢鱼线粒体基因组的碱基组成与其他脊椎动物相同均具有A+T碱基偏向性。4种鱼的线粒体atp6基因中A+T%含量为59%，G+C%含量为41%。

3.2 系统发育特点

Liu等利用mtDNA控制区序列变异探讨了鲤科鱼的系统发育关系。本文通过构建4种鲤科鱼类武昌鱼（又称团头鲂）、彩鲫、草鱼、鲢鱼与GenBank中其他17种鱼类mtDNA基因组进化树并分析，发现武昌鱼（又称团头鲂）、彩鲫、草鱼、鲢鱼与同属鱼类的遗传距离高达99以上。但下载中的鲤形目胭脂鱼（AY526869）与灯笼鱼目的杂斑狗母鱼（AY524977）的亲缘关系相近（52）。通过对17种鱼类比较发现，其中美洲红点鲑与北极红点鲑之间的遗传距离近且与马鲛属、半线马鲛、澳洲马鲛之间的遗传距离为47。就进化树亲缘关系远近来看，4种鲤科鱼类武昌鱼（又称团头鲂）、彩鲫、草鱼、鲢鱼的线粒体atp6基因在碱基组成、变异位点和核苷酸多样性等方面非常相似，表明它们有较近的亲缘关系。通过对四种鲤科鱼类线粒体atp6基因差异分析，可进行物种的识别、物种鉴定和描述进化趋势、解释物种间差异、分析进化关系等方面的研究分析。