铁蛋白笼形纳米颗粒应用于HIV-1 P24抗原高灵敏检测的研究*

张利沙，曾德军

(1.德阳市第二人民医院检验科，四川德阳 618000；2.德阳市疾病预防控制中心微生物检验所，四川德阳 618000)

医学检验技术在疾病的预防和诊断中发挥重要作用，特别是低丰度指标的检测具有重要价值。生物自组装纳米材料引入生物传感系统并应用于医学检验，能够实现低丰度、高灵敏度的检测[1-4]。铁蛋白作为一种生物自组装纳米材料，操控性好，应用于生物传感系统具有实际意义。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 PCR仪、蛋白电泳装置购自美国Bio-Rad公司；离心机购自德国Thermo Electron公司；冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；核酸电泳仪购自中国北京六一生物科技有限公司；凝胶成像系统购自美国Alpha公司；超声细胞粉碎仪购自美国Sonics公司；微孔板检测仪购自美国Bio-Tek公司；超微量样本分光光度计购自美国Thermo公司；透视电子显微镜购自日本日立公司，型号H7000。

DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、dNTPs等均购自日本Takara公司；PCR产物回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、核酸胶回收试剂盒等均购自美国Omega Bio-Tek公司；所用抗体均购自中国上海优宁维生物科技股份有限公司；蛋白质Marker(Fermentas)、DNA Marker(TransGen Biotech)、BCA Protein Assay Kit(Pierce)、HIV-1 P24抗原酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒等均购自中国上海起发实验试剂有限公司。

1.2引物与测序 DNA测序由中国华大基因测序公司完成，引物合成由中国上海生工生物工程股份有限公司完成，见表1。

表1 引物序列

1.3菌种及质粒 菌种：大肠杆菌DH5α作为目标质粒复制菌种；大肠杆菌BL21(DE3)作为目标质粒表达菌种；大肠杆菌BL21基因组DNA作为扩增生物素连接酶基因序列(BirA)的模板。质粒：pET28a-F-H-Chain作为扩增铁蛋白基因序列(rHF)的模板；pET28a作为承载耦联生物素结合肽(BAP)的铁蛋白基因序列原核表达质粒载体；pCDFDuet作为承载BirA的原核表达质粒载体。所用菌种和质粒均来源于本实验室保存。

1.4方法

1.4.1质粒构建 以pET28a-F-H-Chain为模板，分别以FF1、FF2、FF3为正向引物，以FR为反向引物，经3次PCR扩增出耦联生物素结合肽的铁蛋白基因序列BAP-linker-rHF，NcoⅠ/XhoⅠ酶切并插入pET28a，构成pET28a-rHF-BAP；以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，BF、BR为正反向引物，PCR扩增BirA，NcoⅠ/SalⅠ酶切并插入pCDFDuet，构成pCDFDuet-BirA。

1.4.2生物素化铁蛋白的表达 pET28a-rHF-BAP、pCDFDuet-BirA共转化大肠杆菌BL21(DE3)获得目标工程菌，以终浓度1 mmol/L的异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)，25 ℃，190 r/min，诱导培养10 h；以未经诱导的工程菌为对照，全菌裂解液通过聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)观察目标蛋白表达情况。

1.4.3生物素化铁蛋白的纯化和表征 诱导表达的工程菌经超声破碎，并以40%蔗糖为基质，270 000 r/min超速离心4 h，上清透析去糖，获得纯化的生物素化铁蛋白。分别针对铁蛋白和生物素进行免疫印迹试验(Western blot)验证分析；同时以2%，pH7的磷钨酸负染，透视电子显微镜观察自组装结果，并用Image J图像软件分析处理。采用BCA法蛋白浓度测定试剂盒测定提取纯化的生物素化铁蛋白浓度。

1.4.4生物素化铁蛋白应用于P24检测 以5 μg/mL HIV-1 P24抗体包被酶标板，并以0.5%脱脂奶粉封闭；按照ELISA操作步骤，分别依次加入10倍梯度稀释的HIV-1 P24抗原(1 000～0.001 ng/mL)，每个浓度设3个重复，生物素化HIV-1 P24抗体，链霉亲和素，生物素化铁蛋白(24 μg/mL)，链霉亲和素耦联的辣根过氧化物酶；最后以现配TMB显色，2 mol/L硫酸铵终止反应，450 nm读取吸光度；以蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作线性回归曲线，并与商业HIV-1 P24抗原ELISA试剂盒作对比。

2 结 果

2.1质粒构建 通过基因重组手段将597 bp的rHF-BAP基因片段插入到质粒载体pET28a上，构建出pET28a-rHF-BAP。将966 bp的BirA基因片段插入到质粒载体pCDFDuet上，构建出pCDFDuet-BirA原核生物表达载体。2个表达载体均经限制性酶切和基因测序验证无误。

2.2生物素化铁蛋白的表达 pET28a-rHF-BAP、pCDFDuet-BirA共转化大肠杆菌BL21(DE3)获得目标工程菌。在IPTG的诱导作用下，全菌裂解液经SDS-PAGE显示：在相对分子质量25.0×103和35.0×103大小左右出现2条明显蛋白条带，相对分子质量与耦联生物素结合肽的铁蛋白(23.5×103)和生物素连接酶(32.0×103)蛋白相对分子质量大小一致。见图1。

2.3生物素化铁蛋白的表征 对提取纯化的生物素化铁蛋白进行Western blot验证分析显示：针对铁蛋白和生物素的蛋白印迹均在25.0×103左右处出现目标印迹条带，与耦联生物素结合肽的铁蛋白(23.5×103)相对分子质量大小一致。透射电镜观察纯化的生物素化铁蛋白在体外自组装的情况，发现提取纯化的生物素化铁蛋白悬液存在大量直径为12 nm左右的颗粒状规则结构，与铁蛋白笼形纳米结构一致。通过BCA法测定得出提取并纯化的生物素化铁蛋白原浓度为1.8 mg/mL。见图2、3。

注：L1泳道为诱导后的工程菌裂解液电泳；L2泳道为未经诱导工程菌裂解液电泳
图1生物素化铁蛋白诱导表达电泳结果

注：A表示针对铁蛋白的免疫印迹试验；B表示针对生物素的免疫印迹试验
图2免疫印迹试验验证生物素化铁蛋白

图3 生物素化铁蛋白自组装电镜表征

2.4生物素化铁蛋白应用于P24检测 将提取纯化所得的生物素化铁蛋白应用于HIV-1 P24 抗原ELISA检测中，与商业化HIV-1 P24 抗原ELISA检测试剂盒相比较：按照cut-off=2.1×阴性对照，商业化HIV-1 P24 抗原ELISA检测试剂盒对HIV-1 P24抗原的检测下限为1 ng/mL，展示有生物素的铁蛋白笼形纳米颗粒作桥联的ELISA检测对HIV-1 P24抗原下限达到0.1 ng/mL，检测下限提高10倍。见图4。

图4 生物素化铁蛋白笼形纳米颗粒应用于P24 ELISA检测

3 讨 论

检测技术的更新与发展，特别是对低丰度指标的高灵敏检测的开发能够给临床医疗提供依据和指导，例如HIV-1 P24抗原的高灵敏检测能够提高艾滋病早前期的检出率，缩短检测窗口期，为临床诊治提供指导[5-7]；同时低丰度、高灵敏度的检测也深化和补充了目前医学检验技术中的不足。基于纳米材料的各种特性，将纳米材料引入到检验技术中得到了很好的效果[8-9]，特别是容易通过基因工程改造的生物源性纳米结构，例如病毒颗粒，大部分病毒由单体衣壳蛋白组装形成的规则结构，通过单体分子修饰可在病毒颗粒上展示多分子的功能基团，且这些新改造的病毒颗粒处于纳米水平，应用于生物传感能实现信号放大[10-12]。

铁蛋白具有病毒衣壳蛋白的性质，在体外能自组装形成两种纳米结构，即大铁蛋白笼形纳米颗粒由24个基本元件形成八面体对称的中空结构，外径12 nm，小铁蛋白笼形纳米颗粒由12个基本元件形成四面体对称的中空结构[13]。以大铁蛋白笼形纳米颗粒为对象，通过分子生物学的手段对铁蛋白单体进行生物素化修饰，铁蛋白单体自组装时可将生物素展示于笼形纳米颗粒上，1个纳米颗粒可展示24分子生物素，通过生物素与链霉亲和素的特异性结合，检测信号被放大，提高了检测相对灵敏度。经过验证，将生物素化铁蛋白应用到HIV-1 P24抗原ELISA的检测当中，与商业化HIV-1 P24抗原ELISA试剂盒检测比较，检测下限有明显提高，可以用于检测低丰度的分析指标。

铁蛋白笼形纳米颗粒上功能性分子展示不仅仅局限于生物素，也可以将检测相关联的某种或多种分子展示于铁蛋白笼形纳米颗粒上，构建出单功能或多功能的铁蛋白笼形纳米颗粒[14-15]，实现其特定的检测指标的高灵敏甚至超灵敏检测。

4 结 论

通过基因工程技术，采用分子生物学的手段，成功构建生物素化铁蛋白单体，并在体外自组装形成表面展示有多分子生物素的铁蛋白笼形纳米颗粒。以HIV-1 P24抗原检测为例，将其应用到ELISA检测中，与商业化的HIV-1 P24抗原ELISA试剂盒检测相比，成功实现了检测信号的放大，具有相对较高的检测灵敏度，可用于检测相对丰度较低的分析指标。