86例无创DNA产前检测假阳性病例原因分析*

谢润桂，何 怡，魏顺娣，张晓燕

(东莞市妇幼保健院产前诊断中心，广东东莞 523107)

胎儿染色体非整倍体的无创DNA产前检测(NIPT)是利用大规模平行测序技术对母体外周血中的胎儿游离DNA片段(包含胎儿游离DNA)进行深度测序，并将结果进行生物信息分享，可以从中获得胎儿的遗传信息[1]。目前NIPT已广泛用于产前筛查，13-三体、18-三体和21-三体灵敏度和特异度[2]的检测，但是，同任何筛查方法一样，假阳性和假阴性时常发生。通过临床实践与案例研究发现NIPT结果与实际胎儿核型之间存在差异，其发生率在0.1%～0.3%。该现象的生物学原因主要包括限制性胎盘嵌合、双胎一胎凋亡、母亲染色体异常、DNA拷贝数异常、母血中胎儿DNA含量低以及母亲罹患肿瘤等因素[3-5]。本文通过分析在东莞市妇幼保健院NIPT检测发现的86例NIPT假阳性病例，在胎儿分娩后留取的胎盘组织及母亲外周血标本，采用高通量测序方法进行验证，探讨NIPT产生假阳性的原因，以及相应的预防措施。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2016年10月至2018年7月在东莞市妇幼保健院检测出现的NIPT阳性而羊水穿刺核型分析和CMA检测验证胎儿染色体正常的假阳性病例86例。在胎儿分娩后留取的胎盘组织及母亲外周血标本，采用高通量测序方法进行验证。本研究经东莞市妇幼保健院伦理委员会批准，所有孕妇签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1样本采集方法 样本采集与孕妇分娩后，采集孕妇静脉血7～10 mL，使用Cell-Free DNA BCT 管，采血后颠倒混匀8～10次，24 h后进行血浆分离。同时进行胎盘组织采样，每个胎盘选6个采样点，在胎盘的胎儿面和母体面分别间隔一定位置表层获取3个黄豆大小(长：0.5～1.0 cm,宽：0.5～1.0 cm，深：0.2～0.3 cm)的胎盘组织，用少量生理盐水洗净母血，分别按标注置于对应的2 mL无菌小型离心管中，最后将标本以-20 ℃储存于实验室。

1.2.2高通量测序检测 基因组DNA提取、测序文库构建和质量控制，用试剂盒提取基因组DNA，测定基因组DNA浓度，然后在-20 ℃保存。根据晶芯胎儿染色体非整倍体T21、T18、T13检测试剂盒的说明进行文库构建、质量控制和汇集。使用半导体测序仪用于DNA测序。测序读数被过滤并与人类参考基因组(HG19)比对。

1.2.3NIPT假阳性评估方法 NIPT检测提示染色体异常，而胎儿染色体与羊水核型分析和CMA正常，则判定为NIPT假阳性。本研究采用高通量测序法在胎儿出生后同时检测胎盘和母亲外周血中的染色体异常情况，将检测结果与孕期检测的NIPT结果对比，如果NIPT结果与胎盘测定结果一致，则判定NIPT假阳性来源于胎盘细胞；如果NIPT结果与母血测定结果一致，则判定NIPT假阳性来源于母体细胞。如果两者检测结果正常，无法判定NIPT假阳性的来源，判定为未知来源。

2 结 果

经高通量测序法检测验证，在86例NIPT假阳性标本中64例胎盘检测结果与NIPT相符，母血结果正常，占74.4%，其中检测结果为性染色异常9例，常染色体异常55例；12例母血检测结果与NIPT结果相符，胎盘结果正常，占14.0%，其中检测结果为性染色异常10例，常染色体异常2例；10例胎盘与母血结果均正常，NIPT假阳性来源不明，占11.6%。在64例胎盘来源假阳性病例中有47例为限制性胎盘嵌合，占73.4%。NIPT检测提示常染色体异常的63例中2例证实假阳性来源于母血，占3.2%，而性染色体异常23病例中10例假阳性病例来源于母血，占43.5%。见表1。

表1 86例NIPT假阳性原因验证结果

3 讨 论

孕妇外周血胎儿游离DNA(cffDNA)的NIPT是应用高通量基因测序等分子遗传技术检测孕期母体外周血中胎儿游离DNA片段，以评估胎儿常见染色体非整倍体异常风险[6]。母体外周血中cffDNA片段的浓度非常低(3%～6%)[7]。cffDNA具有独特的生理性质：(1)孕妇血浆中的cffDNA随着孕周的增加而增加[8]；(2)cffDNA均有小片段形式存在，片段长度大都小于300 bp；(3)清除速度快，cffDNA的半衰期为16.3 min，胎盘娩出后的2 h内快速消除[9]。NIPT检测母亲外周血中的片段长度为75～250 bp的cffDNA,并将游离DNA数量定位到染色体相应的位置上，从而得到染色体不同位置DNA数量的比例关系，从而推断染色体是否存在缺失、重复或数目异常。NIPT结果阳性代表胎儿母亲外周血中的各种cffDNA的比例关系不正常，可能是与母亲血液系统相连通胎儿滋养层的异常核型细胞引起,也能是由母亲异常核型细胞本身引起，也可能有一部分来源于通过输血、免疫治疗、器官移植等形式输入体内的外来异常核型细胞导致。母体外周血中cffDNA的来源以及含量变化等生物因素，都会影响NIPT检测准确性，表现为NIPT结果、染色体核型分析及CMA结果三者之间存在不一致情况[10-11]。

NIPT检测的cffDNA绝大部分来源于胎儿滋养层细胞，胎儿滋养层细胞与胎儿都是由同一个合子发育而来，将发育为胎盘，合子形成后，一部分细胞发育成胎盘的细胞系，一部分细胞发育成胎儿的细胞系。正常情况，两者的遗传物质是相同的。如果胎盘细胞系的部分细胞出现有丝分裂错误，那么将会出现限制性胎盘嵌合体，即胎盘出现正常与异常的染色体嵌合体，而胎儿核型正常[12]。这种情况胎盘滋养层细胞释放cffDNA的分子剂量会异常，同时引起孕妇血浆中cffDNA的分子剂量异常，NIPT检测结果显示为阳性，而胎儿染色体是正常的，即出现假阳性结果。本研究发现NIPT假阳性大部分来源于胎盘，占74.4%，其中大部分的胎盘来源假阳性病例验证结果提示限制性胎盘嵌合体。因此胎盘来源的异常染色体是导致NIPT假阳性的主要原因。

母体血浆DNA大部分来源于母体基因组，cffDNA约占10%～20%[13]。虽然在高通量测序前，经过分离和纯化去除了部分的母体基因组DNA，但是如果母血中存在异常DNA，仍会影响cffDNA的测定，出现假阳性结果。性染色体异常在母血中最常见，其中性染色体嵌合是最常见的母体染色体嵌合异常，其发生率1/400[14]。由于女性拥有两条X染色体，而且存在剂量补偿和“选择性失活”现象，女性的X染色体异常通常不会引起严重表型，其中X三体、嵌合型的X单体或X染色体的结构异常女性一般都有生育能力[15]。而对于常染色体异常，数目异常者除21-三体外通常不能存活，也没有生育能力，只有小片段的缺失或者重复携带者才能存活和生育，因此性染色体异常在母体中最常见，性染色体异常携带者比例高是导致母血来源的NIPT假阳性的主要原因。本研究中12例母体来源假阳性有10例是X染色体异常，说明X染色体异常在孕妇中携带率最高。所以NIPT检测时如果性染色体异常，很可能来源于母血，应同时对母体白细胞进行染色体检测，以排除母体来源的可能，将会提高NIPT对性染色体检测结果的准确性，避免病人妊娠期间不必要的紧张和压力。

本研究还有10例假阳性病例同时检测了胎盘组织和母血均正常，NIPT假阳性来源不明。NIPT检测一般在孕早中期距离分娩有6、7个月时间，引起NIPT假阳性的异常cffDNA可能已经消失了，因此，本方法无法找到引起NIPT假阳性原因。对游离DNA剂量变化的来源检测还需要进一步提高现有检测技术。

高通量测序法验证发现胎盘和母血中异常游离DNA释放入母血是NIPT假阳性的主要原因。对NIPT结果为性染色体异常病例，应排除性染色体异常源自母血的可能性。NIPT能够准确检测母血总游离DNA的剂量变化，但无法分辨游离DNA剂量变化的来源。