UBE2T基因表达对鼻咽癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响

郑志刚 华清泉 陈 锋

鼻咽癌是耳鼻喉科常见的严重癌症之一，我国南方是鼻咽癌的高发区，发病因素可能与环境气候有关[1]。对于鼻咽癌的治疗临床上目前有多种治疗方法，但手术过程繁琐并且患者预后不佳[2]，对于这一问题的改进，本研究中创新性的应用了UBE2T基因表达的方式以通过泛素-蛋白酶体途径作用于鼻咽癌中半衰期较短的蛋白和一些结构异常、错构且易于检测观察的蛋白[3]，再此蛋白的基础上通过转染UBE2T特异性siRNA载体，采用MTT法检测与鼻咽癌相关的5-8F细胞增殖、采用Transwell 迁移侵袭试验检测5-8F细胞侵袭及转移并利用Western blotting法检测5-8F细胞中逆转录的UBE2T蛋白表达于鼻咽癌中的显像效果[4]。为此，笔者探讨UBE2T基因表达对鼻咽癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响从而研究出鼻咽癌5-8F细胞可成为鼻咽癌治疗的分支靶标。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

材料主要包含：鼻咽癌细胞系5-8F细胞，空白载体，UBE2T特异性siRNA载体，转录酶和逆转录酶。试剂主要有：TRIZOL试剂、秋水仙素、龙胆紫溶液、无酶的RNA冲洗液、SYBR Green 1 染料、上游引物、下游引物、dNTP。Western blotting检测试剂：30克丙烯酰胺和0.8克N,N'-亚甲丙烯酰胺、4×Tris·cl/SDS,pH 8.8、4×SDS电泳缓冲液、TEMED (N,N,N'，N'-四甲基乙二胺)、10%过硫酸铵。MTT法检测试剂：MTT 0.5克，100 ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基。Transwell 迁移侵袭试验试剂：无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM、 1640完全培养基(也可加到20%血清)，无菌PBS，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS结晶紫)。

1.2 细胞培养和转染

将5-8F细胞放入琼脂培养基中放入细胞保温箱中进行传代培养后，将培养后的细胞随机分为3组即对照组、空白转染组和si-UBE2T组。其中对照组不做任何处理；空白转染组细胞转染空白载体；si-UBE2T组细胞转染UBE2T特异性siRNA载体。分别采用MTT法检测各组细胞增殖情况，采用Transwell迁移侵袭试验检测各组细胞迁移和侵袭，Western blotting法检测各组细胞UBE2T蛋白表达，4～6周期后分别对3组实验结果进行测量与统计，并分析数据结果。

1.3 Western blotting检测

将3组细胞分别进行Western blotting法检测，将培养好的5-8F细胞放在两块干净的玻璃平板之间离心后备用，将配制好的 聚丙烯酰胺分离胶液体并脱气，然后放入10%的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌混匀。按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的丙烯酰胺百分比浓度，将以上两种材料进行充分混合后将分离好的5-8F细胞与混合液一起孵育30 min后进行充分清洗，再将硝酸纤维素膜与5-8F细胞进行混合后显色。

1.4 MTT法检测

将3组细胞分别进行MTT法检测，取冻存的5-8F细胞，按照10 000 r/min的离心速度进行离心分离，每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿，进行裂解操作，4摄氏度冰上采用无酶的RNA冲洗液进行洗涤，再次10 000 r/min离心5 min，得到RNA。将此RNA进行逆转录后再培养以检测各组细胞增殖情况。

1.5 Transwell 迁移侵袭试验

将3组细胞分别进行Transwell 迁移侵袭试验，取冻存的5-8F细胞，按照20 000 r/min的离心速度进行离心后应用基质胶铺板后制备5-8F细胞悬液后检测各组细胞迁移和侵袭情况。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组细胞UBE2T蛋白表达比较

si-UBE2T组UBE2T蛋白相对表达量明显低于对照组和空白转染组(P<0.05)；对照组和空白转染组UBE2T蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1和图1。

表1 各组UBE2T蛋白表达比较

注：a为与si-UBE2T组比较，P<0.05。

1为对照组；2为空白转染组；3为si-UBE2T组。

2.2 各组细胞增殖情况比较

各组细胞培养开始时吸光度值比较差异无统计学意义(P>0.05)；si-UBE2T组培养第1 d、3 d和6 d吸光度值均低于对照组和空白转染组(P<0.05)；对照组和空白转染组培养第1 d、3 d和6 d吸光度值比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组细胞增殖的吸光度值比较

注：a为与si-UBE2T组比较，P<0.05。

2.3 各组细胞迁移能力比较

si-UBE2T组细胞迁移率明显低于对照组和空白转染组(P<0.05)；对照组和空白转染组细胞迁移率比较不具统计学差异，(P>0.05)，见表3。

表3 各组细胞迁移能力比较

注：a为与si-UBE2T组比较，P<0.05。

2.4 各组细胞侵袭能力比较

si-UBE2T组穿膜细胞数明显低于对照组和空白转染组(P<0.05)；对照组和空白转染组穿膜细胞数比较不具统计学差异(P>0.05)，见表4和图2。

表4 各组穿膜细胞数比较

注：a为与si-UBE2T组比较，P<0.05。

1为对照组；2为空白转染组；3为si-UBE2T组。

3 讨论

鼻咽癌的病理病因目前认为与3种因素有关，即遗传因素、病毒因素(主要为EB病毒感染)和环境因素，对于鼻咽癌的治疗临床上方法很多但治疗效果都不确切，本文主要从基因表达层面寻求鼻咽癌治疗的新靶标[5]。

UBE2T基因是1种近年来被发现的泛素偶联蛋白酶，该基因所独特的高表达性与鼻咽癌的发生发展有密切关系[6]，UBE2T基因通过5-8F细胞的上皮间充质胚胎转化后在鼻咽癌的疾病进程中起到癌基因的作用，UBE2T基因能通过抑制鼻咽癌抑癌基因的表达从而促进鼻咽癌细胞的增值、转移和侵袭[7]。本研究证实UBE2T基因对鼻咽癌细胞的干细胞特性具有调控作用，并且证明了UBE2T能够经特异性siRNA载体来调控鼻咽癌相关基因的表达，从而实现其增强鼻咽癌干细胞特性的作用，因此在本研究中显示，可以将UBE2T基因作为鼻咽癌靶向治疗的分支基因靶点[8]，定位准确，疗效确切。

通过对UBE2T特异性siRNA载体的检测5-8F细胞增殖、迁移及侵袭能力。采用MTT法检测各组细胞增殖情况，MTT法是1种检测鼻咽癌细胞存活和生长的方法，在本研究中的检测原理是5-8F细胞RNA中的琥珀酸脱氢酶，能使外源性MTT氧化还原为不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能[9]。当细胞增值时并不影响蓝紫色结晶甲瓒存在于5-8F细胞中的数量，会随着细胞增值而分裂增多，伴随在细胞质中不断裂解为更小的粒子，当5-8F细胞增值趋向最大化完成时，二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在700 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活5-8F细胞增值的数量[10]。在细胞数量处于可控的范围内时MTT结晶形成的量与细胞数成正相关[11]。MTT法特点是灵敏度高、经济，对于测量出的细胞增值的数量数据准确可靠。

采用Transwell检测各组5-8F细胞迁移和侵袭，Transwell检测实验是指将5-8F细胞放入培养板中，培养板中存在上下两个小室，在本研究中上下两个小室内分别存有5-8F细胞上下两层的层培养液以聚碳酸酯膜相隔[12]。应用此膜可将5-8F细胞从不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜进行细胞迁移、侵袭的研究[13]。

本研究中还需应用Western blotting法检测各组细胞UBE2T蛋白表达，该方法是采用聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，被检测物是5-8F细胞转录后的UBE2T基因蛋白[14]。经过PCR扩增分离后蛋白质样品，转移到固相载体如琼脂胶体上，固相载体吸附蛋白质后仍能保持电泳分离的UBE2T蛋白的表达基因的活性[15]。

本研究中表1显示si-UBE2T组UBE2T蛋白相对表达量均值较低说明表达的基因产物与鼻咽癌的特异性较高。表2显示si-UBE2T组培养数天后有较低的吸光度值，说明UBE2T基因表达后的有较多的5-8F细胞增值，表示鼻咽癌在此种基因的调控下可发生增值转移至其他组织器官中甚至会累及到较多的淋巴细胞。表3显示si-UBE2T组细胞迁移率在培养观察数天后较低，说明对于鼻咽癌5-8F细胞有较高的迁移基因的表达性有像内脏器官迁移的危险。表4显示si-UBE2T组穿膜细胞数较低，说明在鼻咽癌5-8F细胞进行基因表达后对周围组织有较强的侵袭性。

本研究的创新性在于首创的利用UBE2T基因表达对鼻咽癌进行靶向定位治疗，可免去临床上其他手术治疗的繁琐性和增强患者预后，细胞增值率、转移率和侵袭周围其他组织的概率大大降低，值得临床其他难治性手术的借鉴。

综上所述，UBE2T基因表达对鼻咽癌细胞增殖、迁移及侵袭能力有影响，能够通过UBE2T基因表达定向治疗作为鼻咽癌分支靶向治疗的靶标。