Beclin1与UCH-L5及LC3在急性髓系白血病中的表达及作用研究

苗玉迪 李艳春 李庆瑞

急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia，AML)是1种源于造血干细胞癌变的疾病，具有治疗困难，容易复发的特点，当前预后因素对AML根据进行分型以便于进行个性化治疗，可分为低危、中危、高危三种，治疗方法通常为先采取诱导化疗使病情达到完全缓解后再行进一步化疗或骨髓移植。AML的致病原因复杂至今尚未完全清楚，可能同遗传学和环境因素的作用有关[1-3]。自噬是细胞清除问题蛋白质和细胞器的过程，具体为用囊泡包裹细胞中问题蛋白或细胞器，然后与溶酶体融合成为自噬溶酶体，逐渐降解内部物质。自噬能产生细胞代谢所需的部分物质[4]。自噬在不仅存在于机体正常生理过程中，在病患时期也可见，其对癌症的发展所起的作用尚不明确。研究发现，自噬与白血病的发生、发展及预后关系密切，大多数白血病细胞中自噬能力都会发生变化。研究表明自噬现象存在于白血病患者骨髓中，自噬缺陷可能可能是骨髓增生异常综合征MDS向AML进展的发生机制[5-6]。自噬是由多种基因调控，自噬相关基因Beclin1是自噬形成过程中的可能1种重要的调控因子，在自噬的发展中发挥重要作用[7]。去泛素化酶UCH-L5是泛素蛋白酶UPS家族一员，研究显示，其同某些肿瘤发生发展有密切关系，UPS是除了自噬以外的真核生物的另1种蛋白降解方式。微管相关蛋白LC3参与自噬体的形成，起定位于自噬泡和自噬泡膜表面[8]。 LC3是标记自噬体的特异性蛋白，其的表达强度与细胞自噬活性关系紧密。目前在急性髓系白血病中，自噬的发挥的作用及其机制尚不明确[9]。本研究拟通过分析AML患者的Beclin1、UCH-L5、LC3基因表达情况，探究自噬同AML的关系，为诊断及治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2017年2月至2018年2月在本院诊断和治疗AML患者80例，划分为AML初发组和缓解组，初发组40例，男性22例，女性18例，年龄18～73岁，平均年龄36.7岁；缓解组40例，男性21例，女性19例，年龄21～68岁，平均年龄39.45岁。另选取健康体检患者40例，男性19例，女性21例，年龄24～70岁，平均年龄37.74岁。AML纳入标准：经临床、血液学、骨髓细胞形态检测，参照《血液病专断及疗效标准》确诊为AML患者，骨髓形态学正常；排除标准：患有肿瘤、感染等严重疾病，处于妊娠或生理期女性，临床病历资料不全者。研究前向患者详细介绍研究内容，患者签署知情同意书，研究获得了本院伦理委员会的批准，三组患者年龄、性别等一般资料无统计学差异。

1.2 主要试剂及仪器

PBS液，淋巴细胞分裂液(上海博升生物科技有限公司)，自噬诱导剂雷帕霉素，自噬抑制剂3-MA，化疗药物阿糖胞苷，离心机(美国Sigma公司),ABI-Prism7500 实时荧光定量PCR仪。

1.3 实验方法

1.3.1 测定各组基因表达 获取健康组、初发组、缓解组患者脊髓液，抗凝保存。将HL-60细胞分为对照组，自噬诱导剂组、自噬抑制剂组、治疗组，在IMDM液体培养基培养至对数生长期，各自加入100 nmol/l自噬诱导剂雷帕霉素、自噬抑制剂3-MA、化疗药物阿糖胞苷，继续培养24 h。RT-PCR检测以上各组Beclin1、UCH-L5、LC3的mRNA表达情况。

1.3.2 RT-PCR检测方法 提取RNA。获取各组患者骨髓液，并与-80 ℃存放备用。取骨髓液、HL-60细胞培养液各2 ml，经抗凝，PBS液处理，加细胞分裂液，经离心机作用分离单个核细胞，提取总RNA，于-80 ℃存储。逆转录。①合成引物机探针。从GeneBank获取ERG、MDR1、BAALC基因碱基序列，应用primer express 3.0设计引物及探针，各组基因以GAPD作为内参，内参基因探针及上下游引物:Beclin1上游为5'-GAAGACACAGGAGGCAGT-GG-3',下游为5'-AGGACACCCAAGCAAGACC-3'。UCH-L5上游5'-GGGTCTTCACCGAGiCTCATTA-3'UCH-L5下游5'-AAGTCGGGAGTCCTGAACCA-3'LC3上游5'-AAACGCATTTGCCATCACA-3'LC3下游5'-GGACCTTCAGCAGTTTACAGTCAG-3'。GAPDH上游5'-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3'GAPDH下游5'-TGGAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。②构建荧光定量PCR标准模板。③ 使用MJ 9700PCR仪进行逆转录。荧光定量PCR反应测定表达值。使用ABI 7500全自动荧光定量PCR仪 (美国ABI公司)进行PCR反应，生成结果并分析计算。反应条件：94 ℃预变性5 min，随后40个循环，94 ℃变性15 s,60 ℃延伸60 s，自动收集荧光，PCR产物经电泳、观察、照相后获取结果。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 不同危险度分级Beclin1、UCH-L5、LC3表达

结果显示Beclin1、UCH-L5、LC3在 AML患者中增强，并随危险度分级升高而升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 不同危险度分层患者的Beclin1、UCH-L5、LC3 mRNA表达

2.2 不同治疗阶段Beclin1、UCH-L5、LC3基因表达

结果显示Beclin1、UCH-L5、LC3在初发组中表达增强，并随危险度分级升高而升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，在缓解组表达较初发组减弱(P<0.05)，见表2。

表2 不同治疗阶段Beclin1、UCH-L5、LC3基因表达

注：初发组与健康组、缓解组比较，P<0.05；缓解组与对照组比较，P>0.05。

2.3 自噬诱导剂作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表达

自噬诱导剂作用后，诱导剂组与对照组比较，beclin1表达增强，UCh-L5基因表达减弱调，LC-3表达增强，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 自噬诱导剂作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表达

2.4 自噬抑制剂作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表达

自噬抑制剂作用后，抑制剂组同对照组比较，beclin1表达减弱，UCh-L5基因表达增强，LC-3表达减弱，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2 自噬抑制剂作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表达

2.5 阿糖胞苷作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表达

治疗AML药物处理后 AML治疗组同对照组比较Beclin1表达增强，UCH-L5减弱，LC3增强，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图3 阿糖胞苷作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表达

3 讨论

自噬是从酵母到哺乳动物的真核细胞均存在的现象，是1个把变性的蛋白质、细胞器通过溶酶体通路降解的重要细胞过程，在应激条件下，自噬能为细胞提供能量，维持细胞生存[10]。自噬功能具有两面性，一方面诱导自噬可抑制肿瘤生长，导致自噬相关细胞死亡，另一方便，自噬可为癌细胞提供营养，清除氧自由基、损伤的线粒体等，能一定程度上维持癌细胞生存[11-12]。自噬既能抑制癌症又能促进癌症的两面性使其在癌症不同阶段发挥不同作用。自噬抑制癌症作用表现在癌症未发生时。自噬具有清除损伤的细胞器，像受损的线粒体，避免其产生大量自由基，为防止基因突变，预防细胞癌变做出贡献。如果自噬能力减弱，会导致受损DNA数量升高，直接增加了癌症发生的风险[13-14]。在癌症起始阶段，自噬功能通常被抑制，以减弱其抑制癌症的能力，当癌症已经发生时，自噬凭借其独特能力，为维持癌细胞生存提高帮助。在化疗药物和放疗等应激条件刺激下，癌细胞的自噬水平明显升高以维持癌细胞生存，在癌症晚期，自噬活动活跃，可能增加癌症细胞耐药性。因此，自噬可能是癌症的一个治疗靶点，有研究显示自噬抑制剂联合mTORCl抑制剂可作为AML的靶向治疗药物[15]。

Beclin1基因近年来被认为是重要的诱导自噬因子，主要作用于自噬启动阶段，是介导其他自噬相关蛋白准确定位的关键因子，直接参与自噬调控过程，是潜在的肿瘤抑制基因[16-17]。本研究显示，Beclin-1基因AML患者中较对照组较健康组和缓解组比较呈现出高表达，同AML的危险度分级呈现正相关关系，这同自噬在癌症不同阶段的作用是相符的，也验证了自噬在AML中发挥了作用，说明Beclin-1同AML预后存在关联。可能原因是由于癌变细胞面临更高的代谢压力，肿瘤细胞为应对营养缺乏，通过Beclin-1提高自噬水平来维持其存活，在在治疗后达到完全释解后，也恢复到正常表达。UCH-15是去泛素化酶UCH家族的主要成员，同时也属于泛素-蛋白酶系统。泛素-蛋白酶体通路主要发挥和终结基因和蛋白质功能，该通路调控着包括细胞的增殖、分化、凋亡，蛋白质的质量控制、降解，基因的转录、修复等几乎所有动植物的生命活动[18-19]。本研究中UCH-L5在AML治疗的不同阶段表达不同，不同危险度分层中表达存在差异，说明UCH-L5同AML预后存在关联。LC3定位于自噬泡膜表面和前自噬泡，参与自噬体的形成，包括Ⅰ型和Ⅱ型两种类型。未发生自噬时，细胞内存在的是胞质可溶性的Ⅰ型LC3，表达正常。自噬发生时，Ⅰ型LC3与磷脂酰乙醇胺(PE)结合转化为Ⅱ型 LC3，表达增强。LC3始终位于胞内自噬体的膜上，鉴于其含量与自噬泡数量相对应，LC3成为了自噬的标志性基因[20]。本研究中，LC3表现了同Beclin1一致的表达现象，清晰的现实了自噬在AML中发挥了作用，也说明LC3同AML预后存在关联。

本研究中，经自噬诱导剂雷帕霉素、自噬抑制剂3-MA和AML化疗药物阿糖胞苷作用后Beclin1、UCH-L5、LC3的基因表达均呈现出明显变化，差异具有统计学意义，其中Beclin1、LC3作为自噬相关基因，表现一致，在诱导剂和化疗药物作用下表达增强，而在抑制剂作用下表达减弱，说明可以通过药物实现调节自噬的水平的目的。而化疗药物阿糖胞苷导致自噬标志物升高，推测可能是由于药物对癌细胞造成了很大损伤，短期内诱发癌细胞增强自噬机制进行抵抗。UCH-L5的表达变化说明自噬抑制剂和诱导剂以及化疗药物可影响UCH-L5的表达，推测UCH-L5同自噬机制存在一定关联。

综上，可见Beclin1、UCH15、LC3在AML患者中呈现高表达，且与危险程度分级正相关，其表达同自噬过程关系密切，推测可通过药物调节三基因表达实现调节自噬而定目的，进而影响AML的治疗。