脑脊液miRNA-22 水平对儿童细菌性脑膜炎的早期诊断及疗效分析

林碧惠 简咏芬 蔡艳 范徐威 杨燕华 王翠敏

脑膜炎是中枢神经系统受细菌、真菌、病毒等感染后出现的软脑膜组织的弥漫性炎性疾病，根据致病因素的不同，可分为细菌性脑膜炎、结核性脑膜炎、病毒性脑膜炎和真菌性脑膜炎[1,2]。在儿童脑膜炎患者中，以细菌性脑膜炎和病毒性脑膜炎最为常见，真菌性脑膜炎发病率最低[3,4]。脑膜炎患儿在发病早期通常表现为发热、头痛、恶心、呕吐，及不同程度精神、人格或意识改变等，不具备典型性临床症状，且目前的主要诊断手段是依靠脑脊液化学、细菌培养鉴定，以及配合利用头颅放射影像学、脑电图等[5]。然而对于脑膜炎患儿，放射学、脑电图等检查手段往往不能配合，给诊断带来一定的障碍。

由于儿童的各类脑膜炎单纯依靠临床表现和早期缺乏细菌培养等检查结果，无法做出病因诊断，因此临床早期经验性选择抗生素进行治疗，对病毒性脑膜炎、结核性脑膜炎及真菌性脑膜炎等不能覆盖，造成治疗方案的错误甚至错过诊疗的最佳时机，患儿容易留下肢体活动障碍、智力障碍，甚至因治疗延误导致死亡[6]。如何于早期更好地明确儿童脑膜炎的病因类型是目前重点的研究方向。大量研究发现，细菌、病毒及真菌所致的脑膜炎早期脑脊液的成分就能出现很大的差别，表现在脑脊液蛋白、干扰素、白介素等。近期研究发现，有系列脑脊液miRNA（如miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155等）在不同病原菌所致的脑膜炎中呈现不同程度的水平及变化趋势，与结核性脑膜炎有明显相关性，miRNA-31 与隐球菌性脑膜炎、病毒性脑膜炎有相关性等[7-9]。miRNA-22 是一种炎症相关的小分子RNA，本研究围绕脑膜炎病原学类型鉴别，其在脑脊液中水平与疾病的临床发展、诊疗效果的相关性报道如下。

资料与方法

一、一般资料

选取佛山市南海区妇幼保健院自2015 年1 月至2018 年3 月收治的82 例脑膜炎患儿和和佛山市第二人民医院同期收治的44 例脑膜炎患儿，其中男性65 例、女性61 例，年龄范围3～15 岁，年龄（8.54±3.52）岁，根据最终诊断结果分为3 组：细菌性脑膜炎组（64 例）、病毒性脑膜炎组（44 例）、结核性脑膜炎组（18 例）。其中，细菌性脑膜炎组中，男性33 例，女性31 例，年龄范围3～15 岁，年龄（8.48±3.58）岁；病毒性脑膜炎组中，男性24 例，女性20 例，年龄范围4～15 岁，年龄（8.68±3.51）岁；结核性脑膜炎组中，男性8 例，女性10 例，年龄范围4～15 岁，年龄（8.39±3.52）岁。各组间患儿在性别构成、年龄差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

二、纳入和排除标准

纳入标准：（1）入院时均为轻型脑膜炎，无需急救处理；（2）入院时为初诊，未经过外院治疗。排除标准：（1）合并免疫缺陷性疾病患儿；（2）近半年来有大剂量使用激素类药物或免疫球蛋白制剂患儿；（3）诊断考虑为混合感染型脑膜炎患儿；（4）重型脑膜炎患儿，需要ICU 治疗的。研究各项操作均得到患者家属的同意并签字，项目的开展得到了本院医学伦理委员会的审批并同意开展。

三、标准治疗方案下治疗效果分型

细菌性脑膜炎患儿根据治疗效果分为3 级：（1）满意：患者经治疗后症状明显改善，第5 天时无明显不适，一般情况良好；（2）一般：患者经治疗后症状有较大改善，第5 天时仍有轻微脑膜炎症状，一般情况尚可；（3）欠佳：患者经治疗后稍有改善，第5 天时仍有轻至中度脑膜炎临床症状，一般情况稍差。

四、脑脊液miRNA-22 的拷贝数测定

通过腰穿获得的脑脊液标本5 mL，通过miRVanaTMPARIS 试剂盒（Ambion 公司，美国）提取样本内总RNA，RNA 的扩增和定量采用生物光谱仪测定。每个样本通过miRNA-22 特异性引物进行逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR），获得cDNA，通过RT-PCR 检测拷贝数。具体方法如下：使用TRIzol 从脑脊液样本中提取总RNA，然后使用Hairpin-itTMmiRNAs qPCR 定量试剂盒（上海吉玛制药技术有限公司）在PCR 仪器上检测miRNA-22 的相对表达量。PCR 循环程序：95℃持续30 s，随后95℃持续5 s，60℃持续30 s，40 个循环[10]。

五、统计学分析

采用SPSS20.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（Mean±SD）表示，2 组组间比较采用两独立样本的t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

一、3 组患儿不同时间点脑脊液miRNA-22 水平比较及变化趋势分析

相较于病毒性脑膜炎和结核性脑膜炎患儿，细菌性脑脊液患儿治疗前miRNA-22 的拷贝数明显更高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。细菌性脑膜炎组经过治疗后，脑脊液miRNA-22 的水平呈现快速下降的趋势，且细菌性脑膜炎患者与病毒性脑膜炎、结核性脑膜炎患儿治疗后脑脊液miRNA-22 的拷贝值差异具有统计学意义（P＜0.05，图1）。

图1 不同病因组脑膜炎患儿脑脊液水平miRNA-22在不同时间点的拷贝数比较

二、细菌性脑膜炎患者不同治疗效果组间miRNA-22 拷贝数比较

细菌性脑膜炎组患儿入院时脑脊液miRNA-22水平差异无统计学意义（P＞0.05），但疗效越差患儿入院时miRNA 的水平更高。疗效满意的细菌性脑膜炎患儿的脑脊液miRNA-22 的拷贝数明显较疗效一般和欠佳的患儿更低，差异具有统计学差异（P＜0.05，图2）。说明miRNA-22 水平一定程度上反应了患儿的病情程度。

图2 细菌性脑膜炎患儿不同疗效组间miRNA-22水平比较

讨论

儿童中枢神经系统的感染是临床常见的儿科疾病，尤其是2～4 岁儿童，免疫功能的不完善、病源环境的接触容易引起爆发性脑膜炎发作，对儿童的身心健康带来很大的危害。中枢神经系统的感染根据致病菌的不同，主要分为细菌性脑膜炎、病毒性脑膜炎、结核性脑膜炎和真菌性脑膜炎，以细菌性脑膜炎和病毒性脑膜炎最为常见[11]。其中，细菌性脑膜炎临床上又称为化脓性脑膜炎，主要致病菌为化脓性细菌，常见为脑膜炎双球菌、肺炎球菌和流感嗜血杆菌，通常通过身体其他部位感染经血途径侵入中枢神经系统，或外伤、颅脑临近部位如中耳炎、鼻窦炎等化脓性细菌的直接侵犯，少数情况下因医源性操作引起的化脓性细菌侵入等途径引发颅内化脓性改变[12]。这类脑膜炎发病率最高，同时其病死率和治疗后后遗症的发生率也最高。对于病毒性脑膜炎，常见的致病病毒为肠道病毒，如柯萨奇病毒A/B、脊髓灰质炎病毒和埃可病毒，其次为单纯疱疹病毒、流行性腮腺炎病毒和腺病毒[13]。结核杆菌性脑膜炎顾名思义为特别致病菌结核杆菌引起的脑脊膜、蛛网膜的炎症反应[14]。真菌性脑膜炎是由真菌感染引起的，中枢神经系统真菌感染引起的脑脊髓蛛网膜炎症通常同时合并有脑实质病变，其发病率相对较低，但目前临床上抗生素的滥用、大量激素的不规范使用及艾滋病高发导致真菌性脑膜炎的发病率逐年增高[15]。各类病原菌所致的小儿脑膜炎发病的早期通常均表现为发热，精神、意识改变，头痛、恶心、呕吐等，无明显特征，对病因学诊断无明显帮助。目前临床诊断常常需要进行脑脊液的细菌学培养及鉴定，但是获得结果需要花费时间较长，且病毒性脑膜炎、真菌性脑膜炎等常出现阴性结果[16]。因此，小儿脑膜炎患者早期的治疗通常为进行广谱强力抗生素的覆盖，以期待达到对发病率最高的化脓性脑膜炎的控制，然而对真菌性脑膜炎、结核性脑膜炎、病毒性脑膜炎患儿，不可避免地出现耽误治疗的情况。

对脑膜炎患者的早期病原菌型诊断是临床医学科学研究重点重点之一，研究也发现了大量线索能够对早期病原菌的分型的确定起到重要指导。外周血白细胞计数、降钙素原、C 反应蛋白是常用的炎症指标，其浓度异常升高对化脓性脑膜炎的诊断有一定的指导意义，但以上指标外界影响因素大，诊断的特异度和敏感度不够理想，且对非化脓性脑膜炎的病原菌分型的确定无明显意义[17]。相比较血清学检查，脑脊液的生化检查对脑膜炎患者病原菌的诊断意义更加明确。脑膜炎患者因病原菌的不同，脑脊液内蛋白、细胞因子以及病原菌表达的miRNA 等可表现出一定的浓度、变化趋势的特殊性，为病原学诊断提供了线索[18]。miRNA 是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA 分子，主要参与基因转录后的基因表达调控，通常以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在。其在细胞的增殖、凋亡，细胞的分化、迁移，肿瘤的发生、发展等各种生理生化过程中具有重要的作用。在中枢神经系统脑脊液中，也能检测到miRNA 的存在，且含量的变化与某些疾病有着密切的关系[19]。miRNA-22 在机体内有重要的作用，其高表达能够改善心肌梗死后心功能情况，也能够调控髓母细胞的增殖、凋亡，在肝癌等癌细胞中能够调控恶性进展，在中枢神经系统中，有研究发现miRNA-22 的水平与中枢神经退行性病变、胶质瘤细胞的迁移有一定关系[20-22]。但目前关于脑脊液miRNA-22 水平与儿童脑膜炎的病原学类型是否有关系尚无明确报道。本研究表明miRNA-22在细菌性脑膜炎患儿脑脊液中的拷贝数较病毒性脑膜炎、结核性脑膜炎高，在病毒性脑膜炎患儿脑脊液中的拷贝数最低，且3 组病原菌型患儿经常规标准抗菌治疗后，细菌性脑膜炎患儿脑脊液中的miRNA-22 拷贝数呈现显著降低趋势，而在病毒性脑膜炎、结核性脑膜炎患儿的脑脊液中拷贝数无明显变化。通过进一步分析细菌性脑膜炎患儿组内不同治疗效果的差异与脑脊液中miRNA-22 拷贝数的差异变化发现，治疗效果满意患儿的脑脊液中miRNA-22 的拷贝数在治疗后的下降趋势显著大于治疗效果一般和欠佳的患者。

综上所述，脑膜炎患儿脑脊液中miRNA-22 拷贝数的水平对早期区分脑膜炎患儿病原菌的类型有一定的参考价值，细菌性脑膜炎患儿脑脊液中的miRNA-22 拷贝数明显升高，且miRNA-22 拷贝数与细菌性脑膜炎患儿的预期治疗效果可能存在一定相关性，需进一步研究验证。