老年胆囊癌患者手术前后血清VEGF-C及其受体fms样酪氨酸激酶4水平变化及其临床意义

王绍勇，邓小凡

(1.成都市第十一人民医院外一科，四川 成都 610081；2.四川省医学科学院·四川省人民医院外六科，四川 成都 610072)

胆囊癌位居胆道恶性肿瘤首位[1]，症状缺乏特异性，早期诊断困难，出现明显症状时，已属晚期，生存率低，尤其老年患者基础状况差，预后更差[2]。手术是胆囊癌主要治疗途径，但即便胆囊原发灶浸润程度低，仍可能存在肝脏浸润或淋巴结转移，根治困难[3]。目前认为肿瘤侵袭转移是其主要致死原因[4]，而淋巴管在恶性肿瘤生长转移中有重要作用，可为肿瘤生长提供必需营养物质，增加生物异质性，促成其浸润、转移[5]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)系调节大部分肿瘤新生血管生成的关键因子，近期被证实在肺癌、肝癌淋巴转移中有重要作用[6，7]。其中VEGF-C为诱导淋巴管内皮增殖及趋化的特异性因子，属淋巴管有丝分裂素，其受体fms样酪氨酸激酶4(fins like tyrosine kinase 4，Flt-4)特异性表达于淋巴管内皮细胞，促进癌细胞淋巴管生成，促成肿瘤淋巴转移[8]。但有关VEGF-C及其受体Flt-4在老年胆囊癌中的表达及作用尚未见报道。本研究采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)对老年胆囊癌患者手术前后VEGF-C、Flt-4水平进行检测，与胆囊腺瘤样息肉进行对照，并将胆囊癌VEGF-C、Flt-4水平与患者临床病理参数的关系展开研究，旨在明确两者在胆囊癌发生、进展及转移中的作用，为胆囊癌临床诊治提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料2014年1月至2018年4月成都市第十一人民医院收治的72例老年胆囊癌患者(病例组)。纳入标准：①经手术病理证实为胆囊癌；②年龄≥60岁；③初发初治，接受腹腔镜胆囊癌根治术，术前均未接受放化疗或其他抗肿瘤治疗；④临床资料完善。选取同期收治的42例老年胆囊腺瘤样息肉患者作为对照组。纳入标准：①病理证实为胆囊腺瘤样息肉，接受腹腔镜息肉切除术；②留存血样标本；③临床资料完善。排除标准：①均排除慢性肝炎、肝硬化；②心肾肺器质性功能障碍；③合并严重脑血管病；④合并其他恶性肿瘤；⑤继发胆囊癌；⑥合并严重精神疾病；⑦预计生存期<3月；⑧临床资料不全。病例组男31例，女41例；年龄60～79岁[(70.5±5.7)岁]；美国肿瘤联合会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)第7版TNM分期[9]：Ⅰ期12例，Ⅱ期27例，Ⅲ期28例，Ⅳ期4例；分化程度：低分化10例，中分化23例，高分化38例；病理类型：腺癌66例，鳞癌6例；肿瘤位置：升结肠14例，横结肠18例，降结肠13例，乙状结肠27例。对照组男18例，女24例；年龄61～78岁[(70.6±5.4)岁]。

1.2 方法两组均采集术前1 d、术后1 周空腹外周血标本5 ml，静置2 h后离心20 min，1000 r/s，取上清液低温(-80 ℃)保存，采用ELISA法测定VEGF-C、Flt4水平，VEGF-C、Flt4 ELISA法试剂盒购自美国R&D公司，仪器为美国Bio-Rad公司Mlcroplate reader 800型酶标仪。待测样本室温融化，按说明书稀释标准品、血清，加入样本孔，封板，摇床孵育2 h，洗板4次，加入耦合物，封闭，摇床孵育2 h，洗板，混合显色剂，加入孔板，避光孵育2 h，终止液终止反应，450 nm酶标仪读取光密度值(optical density，OD)，绘制标准曲线，软件计算样本浓度。

1.3 观察指标收集老年胆囊癌患者临床资料，包括性别、年龄、肿瘤直径、临床分期、病理分级、淋巴结转移、肝脏侵犯等，分析术前1 d VEGF-C、Flt4水平与临床病理参数的关系。

1.4 统计学方法采用SPSS 20.0软件分析数据。计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验或Fisher确切概率法；受试者工作特征曲线(ROC)评价血清VEGF-C、Flt4预测胆囊癌淋巴结转移的价值；相关分析采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组VEGF-C、Flt4水平比较病例组术前1 d VEGF-C、Flt4均高于对照组(P<0.05)，术后1周，两组VEGF-C、Flt4均降低，对照组低于病例组(P<0.05)，见表1。

表1 两组手术前后VEGF-C、Flt4水平比较 (pg/ml)

2.2 不同人口学资料胆囊癌患者血清VEGF-C、Flt4水平比较不同性别、不同年龄胆囊癌患者VEGF-C、Flt4水平比较差异无统计学意义(P> 0.05)，见表2。

2.3 不同病理资料胆囊癌患者血清VEGF-C、Flt4水平比较不同肿瘤直径、病理类型胆囊癌患者VEGF-C、Flt4水平比较差异无统计学意义(P> 0.05)，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、分化程度为中低分化、伴肝脏侵犯、伴淋巴结转移的老年胆囊癌患者VEGF-C、Flt4高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、分化程度为高分化、不伴肝脏侵犯及淋巴结转移的胆囊癌患者(P<0.05)，见表3。

表2 不同人口学资料老年胆囊癌患者血清VEGF-C、Flt4水平比较 (pg/ml)

表3 不同病理资料胆囊癌患者血清VEGF-C、Flt4水平比较 (pg/ml)

2.4 血清VEGF-C、Flt4预测胆囊癌淋巴结转移的价值分析ROC曲线分析显示：VEGF-C预测胆囊癌淋巴结转移曲线下面积为0.827(95%CI：0.734～0.919)，当临界值为388.83 pg/ml时VEGF-C预测胆囊癌转移敏感度及特异性最高，分别为85.70%、73.30%；Flt4预测胆囊癌淋巴结转移曲线下面积为0.744(95%CI：0.631～0.858)，当临界值为513.541 pg/ml时Flt4预测胆囊癌淋巴结转移敏感度及特异性最高，分别为82.10%、57.80%，图1。

2.5 老年胆囊癌患者血清VEGF-C与Flt4表达相关性分析老年胆囊癌患者血清VEGF-C与Flt4表达呈正相关(r=0.491，P<0.001)，图2。

图1 血清VEGF-C、Flt4预测胆囊癌淋巴结转移ROC曲线

图2 老年胆囊癌患者血清VEGF-C与Flt4表达相关性分析

3 讨论

胆囊癌约占胆道肿瘤的80%～95%，起病隐匿，恶性程度高，预后差，进展期或中晚期胆囊癌5年生存率低于5%，中位生存期低于6个月[10]。实体瘤生长、进展及转移均与新生血管生成密切相关，癌细胞通过淋巴管及血管扩散至其他器官系恶性肿瘤典型生物学特点，同时也是影响患者预后的关键，故必须重视淋巴管生成在癌症进展中的作用。VEGF-C属VEGF家族分泌性二聚体糖蛋白，主要分布于血管内皮细胞、肿瘤细胞及纤维母细胞内，属内皮细胞特异性丝裂原及血管通透因子，具有刺激淋巴管及血管生成双向作用，可与其受体Flt4特异性结合，调节淋巴管内皮细胞生长因子生成，诱导肿瘤生长、进展及转移[11]。目前已证实肺癌患者癌组织VEGF-C呈明显高表达。但对老年胆囊癌患者血清VEGF-C的作用尚少见报道。本研究发现，老年胆囊癌患者血清VEGF-C表达水平明显高于良性胆囊腺瘤样息肉患者，推测VEGF-C可能存在促进肿瘤细胞生长作用，且与胆囊癌恶性生物学行为密切相关。分析机制为：VEGF-C作用为旁分泌形式，可与受体Flt4特异性结合，引起Flt4磷酸化，活化细胞骨架蛋白，促成淋巴管内皮细胞迁移；同时激活RAS/MAPK或JNK信号通路，诱导淋巴管内皮细胞激动蛋白重组，刺激癌细胞增殖及DNA有丝分裂，促成癌组织淋巴管生成及迁移。在进行手术治疗后患者VEGF-C均明显降低，这与手术治疗后胆囊癌患者肿瘤负荷降低，癌细胞淋巴管及新生血管血流阻滞后VEGF-C表达降低有关。

Flt4属络氨酸激酶，在胚胎发育初期存在于所有内皮细胞内，后期主要分布于小静脉及淋巴管，为成熟淋巴管内皮细胞特异性标志。研究发现，癌组织周边新生淋巴管、肿瘤转移组织淋巴结内淋巴内皮细胞均可见Flt4高表达。在同一组织内，VEGF-C与Flt4亲和力较强，两者形成淋巴管生成信号转导通路，协同调控癌细胞间质血管网及淋巴管生成。本研究发现，老年胆囊癌患者血清Flt4表达水平较良性胆囊腺瘤样息肉患者高，与VEGF-C表达趋势一致，两者表达呈正相关，在手术治疗后降低，推测VEGF-C上调Flt4表达，两者存在正性调控协同作用，考虑胆囊癌患者癌细胞自分泌辅以旁分泌途径产生VEGF-C后作用于细胞膜Flt4受体，导致Flt4表达上调，刺激癌细胞浸润、迁移；而在根治性切除术后肿瘤血管活性降低，VEGF-C表达减少，所刺激生成的Flt4表达降低。王若帆等[12]认为，VEGF-C及Flt4表达与肿瘤直径无关。本研究发现，不同直径胆囊癌患者VEGF-C、Flt4表达差异无统计学意义，与上述结论相同，故认为肿瘤直径与胆囊癌淋巴结转移无明显关联。对VEGF-C、Flt4表达与肿瘤分化程度的关系目前尚存在一定的争论。陈晨等[13]认为，分化程度较低的癌组织VEGF-C表达水平较高。也有观点认为，肿瘤分化程度与VEGF-C表达无明显关联。本研究发现，年龄、性别与胆囊癌患者血清VEGF-C及Flt4表达无关，而中低分化程度的胆囊癌患者血清VEGF-C及Flt4表达水平高于高分化患者，且VEGF-C、Flt4表达与胆囊癌临床分期有关，提示两者均与胆囊癌恶性进展有关，一般分化程度较低的胆囊癌患者细胞恶性生物学行为更典型，细胞增殖、转移速度快，新生血管生成更多，故VEGF-C、Flt4表达水平较高。

本研究还发现，VEGF-C、Flt4表达与胆囊癌肝脏侵犯及淋巴结转移有关，分析机制可能为：VEGF-C通过与受体Flt4作用可诱导胆囊癌淋巴管生成；血清VEGF-C受体Flt4表达上调可进一步提升淋巴管内皮细胞对VEGF-C的反应性，诱导淋巴管增生；而增生淋巴管增多为癌细胞淋巴管转移及侵犯奠定了基础，促进胆囊癌淋巴结转移及肝脏侵犯。此外，本研究进行ROC曲线分析发现VEGF-C、Flt4预测老年胆囊癌淋巴结转移价值均较高，当VEGF-C临界值为388.83 pg/ml时VEGF-C预测胆囊癌转移敏感度及特异性别为85.70%、73.30%；Flt4临界值为513.541 pg/ml预测胆囊癌淋巴结转移敏感度及特异性分别为82.10%、57.80%，两组预测淋巴结转移曲线下面积分别为0.827、0.744，VEGF-C整体价值略优于Flt4，为本研究的创新点，提示两者均有望作为推测老年胆囊癌是否存在淋巴结转移的依据。