17β雌二醇调控MALAT-1抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移

王 娟，刘青青，冯余宽

(1.四川省第四人民医院妇科，四川 成都 610016；2.四川大学华西第二医院妇产科，四川 成都 610041)

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤，死亡率居妇科肿瘤首位[1，2]。雌激素受体与乳腺癌、子宫内膜癌等多种女性恶性肿瘤的发生、发展和预后有关[3]。与乳腺癌不同，雌激素与卵巢癌的关系仍然存在争议[4]。近年研究发现，雌激素及其受体在卵巢癌中的异常表达与卵巢癌患者的发病机制、预后及对化疗反应有关，但其与卵巢癌预后的关系始终存在争议[5，6]。大规模的深度基因测序显示，一些没有蛋白编码能力的长链RNA影响细胞的增殖、凋亡和细胞周期，从而对肿瘤等疾病中有巨大的调控作用[7，8]。其中MALAT-1被证实在非小细胞肺癌，卵巢癌，结直肠癌和肝癌等多种恶性肿瘤中高表达，其表达水平与肿瘤进展呈正相关。多项研究显示MALAT-1能影响上皮性卵巢癌细胞的增殖、迁移、细胞周期和凋亡[7]。而MALAT-1下游基因和雌激素调控通路靶基因有重叠[9，10]。本课题拟在以往病理检测的研究外，利用细胞模型检测雌激素及雌激素受体对卵巢癌的影响，并初步探讨雌激素和MALAT-1的相互关系。

1 材料与方法

1.1 材料本实验时间为2018年9月至2019年3月。人卵巢癌癌细胞系A2780和OVCAR3购自ATCC细胞库，胎牛血清购自BI公司，青链霉素购自Roche公司，强力霉素购自Sigma公司。长链聚合酶链反应试剂盒购自Roche公司，NheI和HindIII限制性酶购自Takara公司，RNA提取及反转录试剂购自Qiagen公司。划痕实验试剂盒购自Cell Biolabs公司。软琼脂购自Beckton Dickinson GmbH公司。细胞增殖检测试剂盒购自Promega公司。引物序列在成都擎科公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养 人卵巢癌癌细胞系A2780和OVCAR3在1640-F-12培养基中添加10%胎牛血清、100 U /ml青霉素、100 lg/ml链霉素，培养环境为37 ℃、5%CO2。细胞均购自ATCC细胞库。在RPMI 1640中培养，添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 lg/ml链霉素，培养环境为37 ℃、5%CO2。

1.2.2雌激素受体表达载体的克隆和转染 使用长链聚合酶链反应(Expand Long Ranged NTPack，Roche Diagnostics)扩增人雌激素受体的编码序列(1788bp)。NheI限制性酶位点包含在PCR引物1(5’-GCCGGCTAGGCATGCCATGACCTCCACCA-3’)中，HindIII限制性酶位点包含在引物2(5’-CCTTAACCGACCGTGGAACCC-3’)中。反应步骤如下：①预变性95 ℃、5 min；②35次循环：变性95 ℃、30 s，退火58 ℃、30 s，延伸72 ℃、3 min；③最终延伸72 ℃、10 min。PCR产物进行凝胶电泳，从凝胶中切出正确大小的条带。用NheI和HindIII消化PCR产物，插入pcDNA3.1(Life Tech.)的克隆位点。

1.2.3短发夹RNA结构的设计与克隆 在DSIR(Designer of Small Interfering RNA)上设计了以人MALAT-1为靶点的短发夹pinRNA(shRNA)序列和作为阴性对照的乱序序列。并亚克隆到psilencer 4.1-cmv-neovector中。核苷酸序列如下：shRNA-F(5’-GGAAGATAGAAACAAGATATATCTTGTTTCT ATCTTCC -3’)；shRNA-R(5’-GGAAGATAGAAACAAGATATATCTTGTTTCTATCTTCC -3’)；阴性对照shScramble-F(5’-AGATCCGTATAGTGTACCTTATAAGGTACACTATACGGATCT -3’)；shScramble-R(5’-AGATCCGTATAGTGTACCTTATAAGGTACACTATA CGGATCT -3’)。将载体导入MB231细胞后，将新霉素(1 mg/ml，Sigma-Aldrich)加入培养基中，获得稳定表达shRNA的细胞克隆。

1.2.4定量mRNA分析 采用qiagen rneasy小型试剂盒提取总RNA。每个样本总RNA的1 lg用莫洛尼鼠白血病病毒逆转录系统(Life Tech)和随机六聚体引物进行逆转录。人PSF基因的引物为：人(NR002819)Forward(5’-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG -3’)；Reverse(5’-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGGCA -3’)。在Applied Biosystems 7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems)上进行定量PCR反应。利用熔融曲线分析了PCR产物的特异性。在进行聚合酶链反应时，每个样本都被复制。采用GAPDH作为内部对照。

1.2.5划痕试验(Cell Biolabs) 划痕试验用于分析野生型A2780、E2处理的A2780和MALAT1敲除的细胞的迁移水平。根据制造商的说明，每孔加入2×105个细胞。移除插入物(0 h)后，采集伤痕区域的图像。24小时后记录伤痕闭合情况。采集图像使用配备了数码相机(Leica DFC300FX)的相差显微镜(Leica Microsystems)，并使用Adobe Photoshop CS3软件对采集到的图像进行分析。

1.2.6软琼脂细胞集落成形试验 35 mm组织培养皿每个加入3 ml培养基(MEM；Invitrogen)和10%FBS、0.33%bd Difco琼脂(Beckton Dickinson GmbH，海德堡，德国)分别制成软琼脂，再分别加入约5×103个野生型A2780、E2处理的A2780和MALAT1敲除的细胞，在37 ℃、5%CO2以及高湿度条件下培养。21天后进行细胞集落计数。

1.2.7细胞增殖测定 平底6孔培养皿的每个孔加入含有10% FBS的MEM，并分别培养野生型MB231、E2处理的MB231和MALAT1敲除的细胞，环境为37 ℃、5% CO2。根据制造商的说明，将Celtiter 96(Promega Corporation，Madison，WI)添加到每个孔中。为了测定细胞活力，每24小时使用550 BioRad平板阅读器(Bio-Rad，Hertfordshire，UK)测量490 nm处的吸光度。每个样品在分析中重复三次，并分别独立重复两次。100 lL DMEM用作空白对照。

1.3 统计学方法使用SPSS 10.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，比较采用t检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高浓度雌激素(E2)抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移为了检测E2对卵巢癌细胞增殖和肿瘤克隆形成的影响，1 nM和100 nM浓度的E2分别被加入A2780和OVCAR3细胞系中，培养7天后，发现低浓度1 nM E2对细胞的增殖没有影响，但当E2浓度增加到100 nM后，两种细胞的增殖都受到了抑制(图1a)。随后检测了高浓度E2对其他常见女性肿瘤的影响，实验显示高浓度E2对宫颈癌和肺癌细胞增殖没有影响(图1b)。随后我们利用软琼脂克隆成形实验检测高浓度E2对卵巢癌细胞克隆形成的影响，发现100 nM的E2能抑制肿瘤克隆形成 (图1c)。划痕实验被用来检测高浓度E2对细胞迁移的影响，100 nM的E2处理A2780、OVCAR3细胞24 h后进行划痕，划痕后24 h拍照观察发现，未被E2处理的A2780细胞划痕面积大大缩小，而E2处理的A2780细胞划痕几乎没有变化(图1d)。OVCAR3细胞划痕面积有减少，但没有A2780细胞明显，未在图中展示。

图1 雌激素对卵巢癌细胞增殖和迁移的作用 a.A2780和OVCAR3细胞接受不同浓度雌激素处理后的生长曲线；b.宫颈癌细胞Hela和肺癌细胞A549细接100 nM浓度刺激处理后增殖变化；c.A2780和OVCAR3细胞接受100 nM浓度处理后单细胞克隆成形；d.A2780接受100 nM浓度处理后划痕恢复情况。

2.2 雌激素以ERα依赖的方式下调MALAT-1抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移MALAT-1在卵巢癌中高表达，而MALAT-1下调抑制细胞迁移和侵袭[5，6]。Malat-1特异性的shRNA被转染进A2780细胞，发现与100 nM雌激素处理相似，A2780细胞的增殖下降(图2a)，迁移也下降(图2b)，荧光定量PCR的结果显示，在雌激素处理后，A2780细胞中MALAT-1的表达水平降低(图2c)。

雌激素有多个受体，为了找出雌激素对MALAT-1的调控方式，ERα和ERβ特异性的shRNA被分别转染入A2780细胞，并用强力霉素筛选获得稳定缺失ERα雌激素受体表达的A2780-αKD细胞和稳定缺失ERβ雌激素受体表达的A2780-βKD细胞(图2D)。对2780，A2780-αKD 和A2780-βKD细胞用100 nM雌激素处理24 h后检测MALAT-1表达，发现只有A2780-βKD细胞中其表达水平未受影响(图2E)。

2.3 雌激素在转录水平调控MALAT-1的表达为了探索雌激素调控MALAT-1的可能的机制，100 ng/ml的放线菌素D和E2被分别加入A2780细胞，24 h后检测MALAT-1 RNA水平，发现MALAT-1的表达都下调了(图3a)，推测雌激素是在转录调控MALAT-1，因为MALAT-1的半衰期没有缩短。为检测雌激素对MALAT-1的调控是否是可逆，在雌激素处理24 h后，更换培养基，检测RNA水平发现恢复到处理前(图3b)，划痕实验也显示，在去除雌激素后，A2780细胞的迁移能力也恢复了(图3c)。综上所述，雌激素在转录水平调控MALAT-1表达，其对MALAT-1的转录调控是可逆的。

3 讨论

过去四十年，应用激素治疗上皮卵巢癌并无重大进展，各种研究结论不尽相同[11，12]，直到最近，通过确定与预后相关的标志物对上皮性卵巢癌激素治疗的人群进行研究，才为雌激素替代治疗提供了新的依据，将雌激素受体作为治疗靶点[5，13，14]，因此雌激素替代治疗对卵巢癌的治疗十分重要[4]。尽管雌激素受体的阳性表达率在上皮性卵巢癌中占到了67%[15]，但是针对雌激素的治疗目前取得的进展很少，雌激素及其受体的治疗效果和治疗价值也没有系统性研究[4]。此外，由于研究的样本量较小，卵巢癌病理类型的不同，卵巢癌细胞激素受体表达情况的复杂性和评估效果的生物标志物的不统一，目前并无一致的定论[11]。因此，本课题从细胞模型入手，发现雌激素对卵巢癌细胞具有剂量效应，在低剂量下，不能抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移，在高剂量下，能抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移。这种剂量效应提示了在雌激素替代治疗中，要加强对患者体内雌激素表达水平的检测，及时根据患者体内雌激素表达的水平调整雌激素补给量。

图2 雌激素通过雌激素受体ERα下调MALAT-1 a.A2780细胞下调MALAT-1后细胞增殖曲线，其中Scramble为非特异性shRNA，和PBS均为阴性对照；b.A2780细胞下调MALAT-1后划痕恢复情况；c.100 nM雌激素处理A2780 24 h后MALAT-1的表达水平，其中18 s rRNA为不相干对照；d.在A2780、A2780-αKD和A2780-βKD中检测ERα和ERβ的表达水平；e.在A2780、A2780-αKD和A2780-βKD中检测MALAT-1的表达水平。

图3 雌激素可逆性的调控MALAT-1的转录 a.放线菌素D(ACD)处理后，MALAT-1的表达水平；b.雌激素去除后MALAT-1的表达水平；c.雌激素去除后，A2780细胞的划痕恢复情况

目前的研究显示MALAT-1在促进肿瘤转移中发挥重要作用，其下游基因涉及细胞粘附、细胞迁移和侵袭、能量代谢、细胞周期和细胞增殖多个不同的层次[8]，但目前对MALAT-1的上游调控元件的研究几乎没有。MALAT-1在肿瘤进程中上调的机制目前还不清楚，对影响MALAT-1上调的因素目前也没什么相关报道。本课题的研究结果提示高浓度17β通过ERα下调MALAT-1，ERα是MALAT-1上游调控元件之一，为卵巢癌及其他受MALAT-1上调而发生转移的肿瘤提供了新的治疗靶位点和新的干预手段。

此外，这种作用是依赖雌激素受体ERα的，提示ERα可作为一个潜在的指标用于检测卵巢癌的预后和复发。其中，当ERβ受体被敲除后，雌激素处理使得MALAT-1的下调更多，可能是雌激素受体间存在竞争性关系，当ERβ被敲除后，ERα受体发挥的调控作用获得加强，MALAT-1的转录被抑制得更多。总之，在后续的研究中，我们将收集卵巢癌样本，对卵巢癌进行更仔细的病理划分，探索ERα作为卵巢癌预后的生物标志物的可行性。