扶正中药逆转TLR4过表达乳腺癌紫杉醇耐药的机制

张祥建，张欣欣，马海广，胡晓清

（1.温州市中心医院 肿瘤外科，浙江 温州 325000；2.温州医科大学附属第二医院 妇科，浙江 温州325027）

乳腺癌是严重危害女性健康的最常见的恶性肿瘤，其发病率逐年上升[1]。尽管基于分子分型的乳腺癌的个体化综合治疗提高了乳腺癌的疗效，但肿瘤的原发或继发耐药、远处转移仍是治疗失败的最主要原因。目前中药在乳腺癌的治疗中得到了广泛的应用，包括化疗减毒、增强免疫、抑制转移等[2-4]。也有部分临床研究显示中药与化疗的联合应用，其除了化疗减毒外，还可以逆转肿瘤耐药[5-6]。然而，其具体作用机制仍缺乏科学的理论依据，同时，中药对肿瘤的治疗和逆转耐药作用是否具有一定的肿瘤组织特异性亦缺乏基础数据。因此，本研究从TLR4/NF-κB信号通路的角度，探讨扶正中药抗乳腺癌的机制，及增加化疗药物敏感性的干预靶点，从而为特定的肿瘤表型及靶点进行中西医结合的药物治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂：扶正中药（黄芪30 g、党参12 g、白术9 g、茯苓12 g、仙灵脾15 g、肉苁蓉12 g、山萸肉12 g、巴戟天12 g）制成冻干粉，溶于双蒸水中，经0.2 μm孔径针式过滤器过滤后使用。DMEM、MEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS均购自美国Gibco公司；紫杉醇（paclitaxel，PTX）购自美国Medchem Express公司；MTT、DMSO、碘化丙啶（PI）、牛胰岛素均购自美国Sigma公司；Annexin V/PI试剂盒购自美国Beckman Coulter公司；β-actin抗体及二抗购自上海康成生物科技有限公司。

1.1.2 仪器：恒温CO2细胞培育箱（美国Thermo Forma公司）；低温高速离心机（日本Kubota公司），Synergy2酶标仪（美国Biotek公司）；流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）；Odyssey双色红外激光扫描成像系统（美国Licor公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：MDA-MB-231、T47D人乳腺癌细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库。在含10%胎牛血清、0.01%牛胰岛素、100 U/L青霉素和10 mg/mL链霉素的MEM高糖培养基中培养MDAMB-231细胞，在含10%胎牛血清、0.01%牛胰岛素、100 U/L青霉素和10 mg/mL链霉素的DMEM高糖培养基中培养T47D细胞，37 ℃、5% CO2恒温无菌养育箱中生长，每2 d观察贴壁情况并换液。待细胞生长至80%～90%时，0.25%胰酶消化后按比例传代。选取对数生长期的MDA-MB-231、T47D人乳腺癌细胞进行实验。

1.2.2 细胞增殖检测：MTT法观察细胞增殖情况，将人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、T47D细胞接种于96孔板（1×104个细胞/孔），培养24 h至细胞贴壁后，更换培养液，分别运用1、2、4、8、16、32、64、128 mg/mL益气扶正中药（复方）干预细胞48 h，每一浓度做3个复孔，同时设阴性对照孔（只含细胞、培养液）；配置0.5% MTT溶液，每孔加20 μL，37 ℃温育4 h后弃上清液，加入DMSO（150 μL/孔），震荡10 min使其充分溶解后，用全自动酶标仪于波长490 nm处测得各孔OD值，检测量效关系。计算复方药物对细胞生长的抑制率，并绘制效应曲线，同样的实验重复3次。细胞生存率（%）=（OD药物组-OD空白对照）/（OD药物组-OD空白对照）×100%。用SPSS22.0软件拟合估计IC50值。同样的方法，运用10、20、40、80、160、320、640 nmol/mL PTX干预细胞48 h，观察其对细胞增殖的抑制作用，计算IC50值。用64 mg/mL的扶正中药与PTX 160 nmol/mL单独及联合干预MDA-MB-231、T47D乳腺癌细胞48 h再次检测细胞存活率。

1.2.3 细胞凋亡检测：用64 mg/mL的扶正中药与PTX 160 nmol/mL单独及联合干预MDA-MB-231、T47D乳腺癌细胞，48 h后收集各药物干预后的细胞，胰酶消化，1 000 r/min离心2 min，吸除上清液，PBS洗涤2遍，再次1 000 r/min离心2 min后提取细胞，加70%冰乙醇固定，4 ℃静置过夜。取出固定的标本，1 500 r/min离心5 min，弃去上清，加PBS洗涤细胞2遍，1 500 r/min离心5 min，PBS洗2遍。参照Annexin-v/PI细胞凋亡检测试剂盒方法实验，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4 Western blot：提取各实验组蛋白（64 mg/mL的扶正中药与PTX 160 nmol/mL单独及联合干预MDA-MB-231、T47D乳腺癌细胞48 h），Bradford法定量后制备样品，Western blot法检测Bcl-2、Bcl-xL、Bax及Cleaved caspase 3 蛋白的表达，β-actin作为内参。将等量蛋白样品进行SDS-PAGE常规电泳、转膜，用含5%脱脂牛奶的TBST封闭1 h后，弃去封闭液，加入一抗，封入杂交袋内，4 ℃摇荡过夜。PBST清洗3次后，加入荧光二抗（1:10 000稀释），避光培育1 h，PBST洗涤3次，加入化学底物助其显影、Odyssey红外荧光扫描成像系统读膜，分析各条带灰度值。ImageJ软件读取各条带灰度值。

另制备实验组蛋白（64 mg/mL的扶正中药与PTX 160 nmol/mL单独及联合干预MDA-MB-231、T47D乳腺癌细胞48 h），同法检测TLR4、p-lκBα、NF-κB及β-actin蛋白，β-actin作为内参。

1.3 统计学处理方法 应用SPSS22.0软件对数据进行统计分析，以上实验重复3次。计量资料以s表示，多组比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 扶正中药与PTX对细胞增殖的影响 不同浓度扶正中药干预乳腺癌细胞株MDA-MB-231、T47D，结果显示扶正中药对人乳腺癌细胞株的生长抑制作用较弱，当浓度达128 mg/mL时，细胞存活率约为80%，未达到IC50值，见图1A。PTX为乳腺癌经典化疗药物，经MTT实验证实，PTX对MDA-MB-231、T47D细胞株均有增殖抑制作用，但相同浓度（80、160、320、640 nmol/mL）的PTX对MDA-MB-231细胞株的杀伤作用弱于T47D细胞株，如当浓度达到160 nmol/L时，T47D细胞株的存活率约为44%，而MDA-MB-231细胞株的存活率约为75%，表现为耐药，见图1B。扶正中药与PTX在处理MDA-MB-231细胞株时有协同作用。当160 nmol/L PTX联合64 mg/mL的扶正中药时，对T47D细胞株的杀伤效果没有得到加强，而当作用于MDA-MB-231细胞株时，PTX的细胞杀伤作用得到加强，达到与T47D细胞株相同的抑制效果。见图1C。

图1 扶正中药及PTX对T47D和MDA-MB-231细胞株细胞存活率的影响

2.2 扶正中药与PTX诱导细胞凋亡 扶正中药和PTX合用48 h对T47D细胞株联合作用并不明显，MDAMB-231细胞株中，凋亡率从23%增加到42%（P＜0.05），接近T47D细胞株PTX单药所致的凋亡率46%。见图2。在MDA-MB-231细胞株中Bax和Cleaved caspase 3蛋白经两药联用后较单纯用PTX表达增加（P＜0.05），而Bcl-2、Bcl-xL经两药联用后表达减少（P ＜0.05）；而在T47D细胞株中两药联用相较于单药PTX并未改变Bcl-2、Bcl-xL、Bax及Cleaved caspase 3蛋白的表达，见图3。

2.3 扶正中药通过TLR4/NF-κB信号通路增加PTX抗乳腺癌活性 Western blot检测MDA-MB-231及T47D细胞株的TLR4的表达，结果显示MDA- MB-231细胞株表达TLR4蛋白，而T47D细胞基本不表达TLR4蛋白。联用扶正中药与PTX相较于单用PTX，MDA-MB-231细胞株中TLR4、p-lκBα、NF-κB蛋白表达减少（P＜0.05），意味着TLR4/NF-κB信号通路的抑制。而T47D细胞株中并未看到TLR4、p-lκBα、NF-κB蛋白表达的改变。见图4。

3 讨论

Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）属于I型跨膜糖蛋白家族，广泛分布于免疫细胞以及上皮细胞表面。人细胞表达10种TLRs亚型，其中以TLR4的肿瘤表达谱最为广泛，与肿瘤关系最为密切[7]。有研究表明人乳腺癌组织TLR4高表达，促进乳腺癌细胞的增殖[8]。TLR4/NF-κB信号通路的异常激活不仅与乳腺癌发生、发展、转移密切相关，还与肿瘤的化疗耐药有关。

PTX目前已成为卵巢癌、肺癌、乳腺癌等多种常见恶性肿瘤的一线用药。PTX以细胞内的微管蛋白为作用靶点，将细胞周期阻断于G2/M期并诱导凋亡信号的激活，从而阻断细胞分裂、阻止肿瘤细胞的增殖，发挥抗肿瘤作用。近年来研究显示，PTX除了通过微管改变促进肿瘤细胞凋亡之外，还可以通过激活TLR4 信号途径诱导肿瘤细胞耐药[9]。研究发现，在具有功能性TLR-MyD88通路的卵巢癌细胞（I型EOC细胞）中，用LPS或PTX活化TLR4信号，可使细胞存活的重要调节子xIAP（caspase-3和-9的主要抑制子）和磷酸化AKT的表达增加，促进了卵巢癌细胞生长和对药物的抗性，且TLR4能够介导PTX的黑色素瘤细胞耐药[10]，据RAJPUT等[11]研究，多数乳腺癌临床样本和68%的乳腺癌细胞系中TLR4高表达，并且可能介导PTX诱导的乳腺癌化疗耐药。这与我们的研究相一致，TLR4高表达的MDA-MB-231细胞株表现为对PTX的耐药，而不表达TLR4的T47D细胞株对PTX敏感。

图2 扶正中药促进PTX诱导MDA-MB-231细胞株的细胞凋亡

PTX在抗肿瘤的同时，可启动TLR4/NF-κB信号通路的激活。TLR4可以识别多种配体，其中最主要的是来自革兰氏阴性细菌细胞壁的LPS。目前认为PTX也是一种可被TLR4识别的非病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）分子。尽管PTX与LPS缺乏结构相似性，但两者均能与TLR4结合激活MyD88依懒性信号途径，从而诱导肿瘤细胞释放多种细胞因子或上调抗凋亡信号等一系列的效应[12]。

中医学认为，乳腺癌的发病机制为本虚标实，在应用中医方剂时，应重视健脾益气以辅助正气，温补肝肾以调摄冲任，同时兼顾理气活血，散结解毒。临床和基础研究也发现中药方剂如乳宁冲剂、乳癌术后方、乳宁II号等在防治乳腺癌复发转移方面疗效确切[13-16]。姜华等[17]也证实益气活血复方可阻断TLR4高表达，同时阻断TLR4胞内信号转导的MyD88依懒性途径，抑制下游NF-κB以及各种相关基因表达，从而减少内皮细胞的损失以及各种炎症反应的发生。此外，扶正方剂中的主药白术具有抗炎、抗肿瘤的作用[18]。在本研究中，我们探讨了扶正中药协助PTX抗乳腺癌的作用机制。我们发现对于TLR4高表达的MDA-MB-231细胞株，扶正中药可协同PTX的抗癌作用，逆转其对PTX的耐药，达到TLR4不表达的T47D细胞株对PTX的敏感度。而在TLR4不表达的T47D细胞株中，扶正中药并不能起到联合增效的作用。

Bcl-2家族成员是细胞凋亡调节因子，其中Bcl-2、Bcl-xL和Bax是关键的表现细胞生存/凋亡特征的因子[19]。抗细胞凋亡成员Bcl-2、Bcl-xL能够改变线粒体巯基的氧化还原状态，封闭Bax在线粒体上形成的孔道的活性，使一些小分子不能自由通透，将凋亡蛋白前体Apaf-1等定位至线粒体膜上，使其不能发挥凋亡作用，最终抑制细胞凋亡。而Bax的增加会破坏Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡成员的活性，促进细胞凋亡[20]。caspase 3是细胞凋亡通路下游的执行者，Cleaved caspase 3是caspase 3的激活形态，使细胞发生生化及形态学改变，导致细胞凋亡[20]。在本研究中，我们发现PTX敏感细胞株T47D经PTX处理后，Bcl-2、Bcl-xL蛋白表达减少，而Bax、Cleaved caspase 3蛋白表达增加，细胞凋亡增加。而扶正中药单药处理细胞株T47D后，细胞凋亡未见明显增加，另与PTX联用后，亦未看到增强效果。而细胞株MDA-MB-231经PTX处理后，细胞凋亡有所增加，但未达到在细胞株T47D的程度，当加用扶正中药后，可看到Bcl-2、Bcl-xL蛋白表达进一步减少，Bax、Cleaved caspase 3蛋白表达进一步增加，提示扶正中药在MDA-MB-231细胞株中可增加PTX诱导细胞凋亡的作用，这与流式细胞仪检测细胞凋亡的结果相一致。

图3 扶正中药促进PTX对MDA-MB-231细胞株细胞凋亡蛋白表达的影响

图4 扶正中药通过TLR4/NF-κB信号通路增加PTX抗乳腺癌活性

鉴于PTX的耐药与TLR4激活下游NF-κB通路相关，我们检测了TLR4、p-lκBα、NF-κB蛋白的表达改变。可以看到，在MDA-MB-231细胞株中加用PTX后，TLR4、p-lκBα、NF-κB蛋白的表达增加，意味着TLR4/NF-κB信号通路的激活，从而对PTX产生耐药。而当联用扶正中药与PTX后，TLR4、p-lκBα、NF-κB蛋白的表达受到抑制，TLR4/NF-κB信号通路受到抑制，MDA-MB-231细胞株对PTX重新变得敏感。而在TLR4不表达的T47D细胞株，TLR4/NF-κB信号通路并未发生改变。

综上所述，MDA-MB-231细胞株中，扶正中药可以通过抑制TLR4/NF-κB信号通路增加细胞凋亡，从而增加PTX对MDA-MB-231乳腺癌细胞株的细胞增殖抑制作用，逆转对PTX的耐药。而TLR4 不表达的T47D细胞株，对PTX敏感，联用扶正中药后并不能抑制TLR4/NF-κB信号通路，不能增加细胞凋亡，也不能加强PTX的细胞增殖抑制作用。