AMPK/STAT1通路参与土木香内酯改善H2O2引起的神经细胞PC12凋亡

徐建飞，汪洋，胡旭军，王婳，许兆军

（中国科学院大学宁波华美医院 重症医学科，浙江 宁波 315010）

由天然活性产物衍生的新型抗炎药的发现引起了医药化学家的广泛关注。土木香内酯（alantolactone，ALA）是从土木香根茎中提取的，在古代被用作中草药。它是萜类不饱和化合物中最重要的一类，被认为是治疗神经损伤、癌症和胰岛素抵抗等多种疾病的候选药物[1-3]。最近的研究表明，ALA具有多种抗炎和抗肿瘤药理活性[4-5]。另外，在大鼠外伤性脑损伤中，ALA表现出神经保护的作用[3]。不仅如此，ALA可保护Aβ25-35诱导的小鼠皮质神经元细胞的凋亡，并逆转了东莨菪碱诱导的小鼠认知障碍，进一步的研究表明活性氧簇参与其中[6]。但是ALA对过度氧化应激诱导神经细胞凋亡的具体作用及其机制仍不清晰。为探讨ALA抗神经细胞凋亡的作用，我们以神经细胞PC12 为对象，观察其对H2O2引起的神经细胞PC12凋亡的抑制作用并初步探讨机制，为临床应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料 PC12细胞购自中国科学院基础医学细胞中心。ALA购自上海陶素生化科技有限公司；H2O2购自美国Sigma公司；HRP标记山羊抗体兔IgG/鼠IgG购自美国Santa Cruz公司；抗GAPDH兔单克隆抗体、AMPK鼠单克隆抗体、p-AMPK鼠单克隆抗体、STAT1兔多克隆抗体和p-STAT1兔单克隆抗体购自美国CST公司；蛋白电泳、转膜与曝光系统购自美国Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 神经细胞PC12 培养：将PC12 细胞接种到DMEM高糖培养基（含100 μ/mL链霉素、100 μ/mL青霉素和10%胎牛血清）中培养，每48 h换液1次，2～3 d传代1次，传代2次取生长良好的细胞用于实验研究。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖情况：分别取对数生长期PC12细胞接种于96孔板中，分别加入1、5、10、20、50和100 μmol/L的ALA，在37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养24 h；分别取对数生长期PC12细胞接种于96孔板中，分别加入1、5 μmol/L的ALA提前孵育1 h后，加入H2O2处理，在37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养24 或48 h；每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），继续培养4 h，离心后小心吸尽上清液，每孔加入150 μL DMSO吹打混匀，采用酶标仪于570 nm处读取各孔吸光度值。按公式计算细胞增殖抑制率。

1.2.3 分组：①将PC12 细胞分组，设立正常组、H2O2（100 μmol/L）组、ALA（1、5 μmol/L）组，ALA孵育细胞1 h后再经H2O2处理24 h、48 h，分别进行MTT实验和收集细胞进行细胞流式实验；②将PC12细胞分组，设立对照组、H2O2（100 μmol/L）组、siAMPK组、H2O2+siAMPK组、H2O2+siAMPK+ALA（5 μmol/L）组，PC12细胞经AMPK的siRNA（10 nmol/L）处理细胞24 h后再经ALA孵育1 h，最后用H2O2处理细胞24 h，收集细胞进行Western blot实验。

1.2.4 Western blot检测细胞AMPK、STAT1、p-AMPK和p-STAT1的表达：细胞裂解后，测蛋白浓度并配平每个蛋白的上样量。等量蛋白通过SDS胶进行分级分离，然后湿法转移至PVDF膜上，相对分子质量小的用0.2 μm孔径的膜，相对分子质量大的用0.45 μm孔径的膜。90 min后用5%脱脂牛奶进行封闭，待封闭好后加入一抗（AMPK鼠单克隆抗体、p-AMPK鼠单克隆抗体、STAT1兔多克隆抗体、p-STAT1兔单克隆抗体和抗GAPDH兔单克隆抗体，稀释均为1:1 000），置室温摇床孵育2 h之后移至4 ℃摇床过夜。次日加入HRP结合的二抗（1:3 000），二抗孵育1 h后用TBST洗涤3次。加ECL液避光孵育2 min，曝光仪成像。

1.2.5 siRNA诱导的基因沉默：利用特异性siRNA序列实现细胞内的基因沉默，大鼠AMPK特异性siRNA购买自上海吉玛制药技术有限公司。采LipofectamineTM2 000（美国Invitrogen公司）将10 nmol/L的siRNA转染至PC12细胞，具体操作根据说明书指示进行。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS16.0软件进行统计分析。计量资料以表示，2 组间比较采用Student's t 检验，多组间比较采用单因素方差分析并以Bonferroni校正作后比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 低剂量ALA不影响PC12细胞增殖 不同浓度ALA（1、5、10、20、50和100 μmol/L）处理神经细胞PC12 24 h后，MTT法检测各浓度对PC12细胞增殖的影响。实验结果显示20 μmol/L及以上浓度的ALA可明显抑制PC12细胞增殖（P＜0.05），见图1。表明高浓度ALA对PC12细胞有着细胞毒性作用，可能会影响后续研究，所以后续实验只使用1和5 μmol/L浓度的ALA。

2.2 ALA剂量依赖性抑制H2O2引起的PC12细胞凋亡细胞MTT实验结果显示在H2O2（100 μmol/L）处理24或48 h条件下，与正常组比，H2O2组PC12细胞凋亡明显上升（P＜0.01），经ALA处理后，PC12细胞凋亡得到显著改善，且ALA浓度越高，改善效果越好，见图2A-B。类似的结果可以在流式实验中观察到，见图2C。表明ALA可缓解H2O2诱导的PC12细胞凋亡。

图1 MTT法检测不同浓度ALA对PC12细胞增殖的影响

2.3 ALA抑制H2O2引起的PC12细胞STAT1磷酸化

为探究ALA缓解H2O2诱导的PC12细胞凋亡的作用机制，检测细胞凋亡密切相关蛋白STAT1的磷酸化以及细胞能量代谢调控蛋白AMPK的磷酸化情况。经H2O2处理后STAT1的磷酸化水平明显增高，而1和5 μmol/L ALA预处理显著降低STAT1的磷酸化（P＜0.05），并呈现剂量越高，抑制效果越明显的趋势（P＜0.05），见图3A。ALA组AMPK的磷酸化水平明显上升，并呈现剂量依赖性，见图3B。表明AMPK/STAT1可能参与ALA缓解H2O2诱导的PC12细胞凋亡。

图2 ALA抑制H2O2诱导的PC12细胞凋亡

2.4 ALA通过激活AMPK降低STAT1磷酸化缓解H2O2引起的PC12细胞凋亡 利用siRNA沉默AMPK的表达后，再用ALA处理，结果发现沉默AMPK后，ALA无法降低H2O2诱导的STAT1磷酸化，ALA+siAMPK+H2O2组与siAMPK+H2O2组STAT1磷酸化差异无统计学意义（P＞0.05），见图4A-C；MTT实验结果显示沉默AMPK可逆转ALA的抗凋亡作用，见图4D。表明ALA可能通过激活AMPK降低STAT1磷酸化，从而缓解抑制H2O2诱导神经细胞PC12的凋亡。

3 讨论

在脑缺血性疾病中，神经细胞凋亡是重要的病理进程。近年研究发现，在脑缺血后的几小时内，经一系列生化级联反应引起神经元凋亡，导致相应缺血脑区功能障碍从而引起一系列缺血症状，严重危害人类健康[7]。因此脑缺血后保护神经细胞凋亡以及寻找抗凋亡靶点成为现今抗脑缺血研究热点。本研究发现ALA具有抗神经细胞凋亡的作用，并且发现其作用是基于对AMPK/STAT1通路的调控。

图3 ALA对H2O2诱导PC12细胞STAT1（A）和AMPK（B）磷酸化的影响

图4 ALA通过AMPK调控H2O2诱导PC12的STAT1磷酸化和细胞凋亡

ALA作为中药土木香的主要成分，有研究报道其具有良好的抗肿瘤效果[4，8-9]；更有研究显示ALA可缓解胰岛素抵抗，治疗外伤性神经损伤和多种炎症性疾病[1-2，5，10]。在研究ALA对H2O2诱导神经细胞PC12凋亡的作用时，本研究首先使用了经典的细胞增殖实验MTT实验，检测了不同浓度的ALA对PC12产生的毒性作用。结果发现，较低剂量时（1、5和10 μmol/L），ALA组与对照组MTT实验结果无差异；而当浓度增加到20 μmol/L时，ALA便显示出明显的细胞毒性作用。因此，后续实验选取了较低浓度的ALA（1和5 μmol/L）做进一步的研究。

AMPK是细胞发育过程中的重要调控因子，广泛参与细胞增殖、凋亡、分化、代谢等过程[11]。STAT1被发现是AMPK调控炎症的重要蛋白，其使得生物能量学与细胞炎症联系起来[12]。除此之外，JAK/STAT1作为在缺血性再灌注中起着介导心肌细胞凋亡的作用[13]；不仅如此，更多文献报道其与细胞凋亡有着紧密联系[14]。本研究主要探究ALA对H2O2诱导神经细胞PC12凋亡的作用。本研究采用了细胞流式和MTT的方法检测了不同浓度ALA对H2O2诱导神经细胞PC12凋亡的影响。结果表明：与对照组比，ALA可明显减少H2O2诱导PC12的凋亡，且呈现浓度依赖性。另外，AMPK与STAT1作为一种重要的细胞信号通路可调控细胞炎症信号。本研究也对其进行了检测，结果发现：与H2O2组相比，ALA可明显增强PC12细胞AMPK的激活，同时STAT1在H2O2处理后有明显的激活，而ALA再处理后，STAT1的磷酸化有着显著下调，且呈现剂量依赖性。另siAMPK转染实验表明：siAMPK可逆转ALA对H2O2诱导PC12细胞的p-STAT1抑制作用和抗凋亡作用，说明抑制STAT1的磷酸化的表达后ALA无法实现对STAT1的调控作用。

综上所述，神经细胞PC12受H2O2干预后，STAT1被激活并诱导细胞凋亡，ALA处理后，可显著激活AMPK，同时降低了H2O2诱导的STAT1的磷酸化表达和细胞凋亡。而利用转基因技术进一步实验发现ALA对STAT1的调控作用是通过激活AMPK实现。然而我们的研究仅在细胞层面阐明了ALA通过调控AMPK/STAT1起着神经保护作用，但未能在动物层面论证其抗凋亡作用及对认知功能障碍的保护作用。在后续研究中，我们将深入探究ALA对脑损伤的保护作用。