活体原位电化学检测鼠脑内的过氧化氢和多巴胺

张帅　冯涛涛　张丽　张美宁

摘 要 在脑神经系统中， 过氧化氢（H2O2）和多巴胺（DA）的同时分析具有重要的意义，但二者的同时实时分析具有很大的挑战。本研究制备了可用于二者同时电化学分析的环盘微电极，中间的碳纤维盘（CFdisk）电极通过电化学沉积选择性地修饰普鲁士蓝（PB），并电聚合聚3，4 乙烯二氧噻吩（PEDOT）保护PB，检测H2O2，金环（Auring）电极检测DA。研究结果表明，此电极对H2O2的线性检测范围为1～29 μmol/L，检出限为0.4 μmol/L; 对DA的线性检测范围为0.5～25 μmol/L，检出限为0.18 μmol/L，两电极之间未交叉干扰。采用此电极检测了大鼠脑内的DA和H2O2浓度的变化。本研究为有关H2O2和DA的神经生理和病理的研究提供了新的方法。

关键词 过氧化氢; 多巴胺; 活体; 微电极; 电化学分析

1 引 言

过氧化氢（H2O2）是脑神经系统中重要的调质。一方面，H2O2是活性氧物质（ROS）之一[1，2]，浓度过高会引起大范围细胞损伤，与帕金森综合症等疾病密切相关[3，4]; 另一方面，越来越多的研究表明，H2O2是信号分子[1，5]，不仅是细胞生长和细胞器功能的调节者，也是神经元之间、神经元与胶质细胞间的扩散性信使分子[6]，并且在突触传导和可塑性方面也有着重要作用[7]。如神经元中多巴胺（DA）和6 羟基多巴胺（6 OHDA）的氧化产生H2O2，可调节神经元生理状态[8，9]，在纹状体神经元中，谷氨酸激活α 氨基 3 羟基 5 甲基 4 异恶唑丙酸受体（AMPAR）可在下游产生H2O2，产生的H2O2作为信号分子，通过钾离子 三磷酸腺苷（K ATP）通道抑制轴突释放DA[10，11]。因此H2O2与DA的同时分析对于了解二者的相互作用具有重要意义。

活体原位电化学分析是将微电极植入特定脑区， 对脑神经系统内的物质进行分析的方法[12～20]，因其为时空分辨率高，电极易于微型化、阵列化[21～27]，在脑神经科学中的应用越来越多。但是脑内物质多样，性质相近，多种物质分析必须克服相互之间的交叉干扰[28，29]，因此建立具有高选择性的多组分的原位实时电化学分析方法具有很大的挑战。本研究设计了一个可同时检测两组分的微电极，如图1所示，中间为碳纤维盘（CFdisk），外周为纳米金环（Auring），以H2O2和DA為例，在CFdisk电极上修饰普鲁士蓝选择性分析H2O2，Auring电极检测DA。本研究结果有助于更深入研究脑神经系统中H2O2和DA的生理功能和二者的相互关系。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

CHI760D电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）; 三电极系统：CFdiskAuring电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极; WD 2微电极拉制仪（成都仪器厂）; JPC 200磁控溅射镀膜机（北京泰科诺科技有限公司）; FE20/EL20型实验室pH计（梅特勒 托利多公司）; JSM 7401F扫描电子显微镜（日本电子株式会社）。

K3[Fe（CN）6]、FeCl3、NaOH、浓H2SO4（98%）、乙腈（国药集团化学试剂有限公司）; 3，4 乙烯二氧噻吩（EDOT）、多巴胺（DA）、H2O2（Sigma公司）; pH 7.4磷酸盐缓冲溶液（PBS）由50 mmol/L的KH2PO4 K2HPO4组成; 人工脑脊液（aCSF，pH=7.4）由KH2PO4（0.5 mmol/L）、NaHCO3（27.5 mmol/L）、NaCl（126 mmol/L）、KCl（2.4 mmol/L）、CaCl2（1.1 mmol/L）、MgCl2（2.4 mmol/L）和Na2SO4（0.5 mmol/L）组成; 所用试剂均为分析纯，实验用水均为去离子水，室温（25℃）下操作。

2.2 实验方法

2.2.1 微电极的制备 微电极的制备如图1所示，使用微电极拉制仪在820℃的拉制温度下将玻璃管（i.d. 1.5 mm，L=10 cm）拉制成两个尖端很细的毛细管，拉制完成后，用玻璃刀割开毛细管尖端，控制端口直径为20～30 μm。将碳纤维用导电银胶连接到铜丝上，小心穿入到上述制备好的毛细管中。用502胶将毛细管两端封住，放置过夜，使502胶固化，制备成碳纤维电极（CFE）。再将CFE置于磁控溅射镀膜仪中，在玻璃管外壁镀金层（约350 nm），取出后用铜丝连接金层，并用蜡封金层绝缘，制成金环电极。将制备好的CFE Auring电极用2000目砂纸打磨，制成CFdiskAuring电极，超声，冲洗后备用。

活化CFdiskAuring电极： CFdisk电极在1 mol/L NaOH溶液中+1.5 V电位下活化80 s，然后在0～+1.0 V电位范围内，以50 mV/s的扫速循环扫描至峰电流稳定为止; Auring电极在0.05 mol/LH2SO4溶液中，以50 mV/s的扫速在0.2～ +1.8 V电位范围内循环扫描至峰电流稳定为止。电极活化之后，在CFdisk电极上利用恒电流沉积法（电流密度，2 μA/cm2），在含有1 mmol/L K3[Fe（CN）6]和1 mmol/L FeCl3的KCl（pH=2，0.1 mol/L）溶液中沉积800 s，获得普鲁士蓝（PB）修饰的CFdisk（PB/CFdisk）电极。将PB/CFdisk电极在含10 μmol/L EDOT的乙腈和KCl混合溶液中进行循环伏安扫描2圈，电位范围是0.1～+1.2 V， 扫速为50 mV/s，获得PEDOT/PB修饰的CFdisk（PEDOT/PB/CFdisk）电极。

2.2.3 动物实验 实验动物为雄性Sprague Dawley纯种大鼠（350～400 g）， 购于北京大学医学部实验动物中心，于室温条件下在自然光照周期中自由饮水进食，所有动物实验过程均遵照国家纳米科学中心动物饲养及实验条例。大鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉（345 mg/kg，i.p.），剔除老鼠头部毛发，用酒精消毒后，将大鼠头部固定在立体定位儀上，开颅，去除软脑膜。将双极刺激电极植入到内前侧脑束（MFB）

（Ap=2.2 mm，L=1.6 mm，V=7.3 mm），将制备的环盘微电极植入到伏隔核（NAc）（AP=1.8 mm， L=1.5 mm， V=6.5 mm）。对双极刺激电极施加频率60 Hz，±300 μA的电刺激信号3 s，刺激NAc脑区释放DA。检测H2O2时，将10 mmol/L H2O2以10 μL/min流速注入到NAc区域，记录H2O2信号。

3 结果与讨论

3.1 环盘微电极的制备与表征

图1A为环盘电极的制备过程图，中间为CFdisk电极，并被拉制的玻璃毛细管包被，玻璃管外壁利用溅射的方法镀一层Au膜，为了形成纳米Auring电极，侧壁用石蜡绝缘。所制备的环盘电极电镜表征图如图1C和1D所示，整个电极的外径约为40 μm，CFdisk电极的直径约为7 μm，纳米Auring的厚度约为350 nm。此外，在挑选的毛细管玻璃壁厚度和拉制仪温度下，CFdisk和Auring电极之间玻璃管的厚度约为10 μm。

图2为环盘电极、CFdisk电极和Auring电极在5 mmol/LRu（NH3）6Cl3溶液中的循环伏安图。如图2实线所示，在0.5～+0.1 V的电位范围内，环盘电极中的CFdisk和Auring电极单独施加电位时，两个电极的循环伏安图为典型的稳态伏安曲线，

说明CFdisk和Auring均具有微电极的特征。为了考察CFdiskAuring电极中CFdisk电极和Auring电极之间是否存在扩散层交盖，并且可独立工作，使用两通道，将CFdiskAuring环盘电极中的两个电极同时施加电位，如图2虚线所示，CFdisk和Auring的循环伏安图也为稳态曲线，并且两个电极的电流大小和分别施加电位的图相同，说明两个电极之间未扩散层交盖。上述研究结果说明，此电极可用于两组分的同时检测。

3.2 环盘电极对H2O2和DA的电化学响应

如前所述，利用Auring电极检测电刺激DA的释放，并通过电化学沉积的方法，将对H2O2有选择性催化的PB沉积在中间CFdisk电极上。H2O2虽然具有电化学活性，但是在一般电极上氧化还原过电位很大，氧化电位高于+0.6 V，还原电位低于

0.5 V，而PB在中性溶液中容易结构坍塌，因此用电聚合的方法将导电聚合物PEDOT原位聚合在PB/CFdisk电极上，用以保持PB在中性溶液的稳定性。图3为所制备的电极对H2O2和DA在中性溶液中的电化学响应图。 PB/CFdisk电极修饰PEDOT前后循环扫描25圈的稳定性图如图3A和图3B所示，

图3 PB/CFdisk电极在电聚合PEDOT（A）前和（B）后在PBS溶液中的循环扫描（CV）图，扫速50 mV/s; （C）PEDOT/PB/CFdisk电极在PBS中加入300 μmol/L H2O2前（a）、后（b）的CV图，扫速5 mV/s; （D）Auring电极在PBS中加入100 μmol/L DA前（a）、后（b）的CV图，扫速50 mV/s

Fig.3 CVs obtained at Prussian blue （PB）/CFdiskmicroelectrode in PBS before （A） and after （B） electropolymerized of poly（3，4 ethylenedioxythiophene） （PEDOT） at pH=7.4 and scan rate=50 mV/s; （C） CVsobtained at PEDOT/PB/CFdiskelectrode in PBS in the absence （a） and presence （b） of 300 μmol/LH2O2. Scan rate： 5 mV/s; （D） CVs obtained at Auringelectrode in PBS in the absence （a） and presence （b） of 100 μmol/L DA. Scan rate： 50 mV/sPB/CFdisk电极在+0.18 V有一对可逆的PB的氧化还原峰，氧化还原峰电流在循环扫描的过程中，因为PB在中性溶液中不稳定，电流逐渐减小，而经过PEDOT保护的PB/CFdisk电极，PB的氧化还原峰电流并未明显的降低，说明PEDOT对PB具有很好的保护作用。当在中性PBS中加入300 μmol/L H2O2时，PB的氧化峰电流减小，还原峰电流增加（图3C），说明PB对H2O2具有良好的催化作用。DA在Auring电极上的电化学行为（图3D）表明， DA在+0.18 V处氧化电流到达稳态，说明DA在Auring电极上有很好的电化学响应。

3.3 环盘电极对H2O2和DA的电化学分析

为了避免环盘电极上H2O2和DA的相互干扰，本研究选择PEDOT/PB/CFdisk电极对H2O2的检测电位为0.05 V。首先考察了PEDOT/PB/CFdisk电极和Auring电极对H2O2和DA检测的线性和灵敏度，结果如图4所示。由图4A可见，在0.05 V电位下，在PBS溶液中连续加入一定浓度的H2O2时，PEDOT/PB/CFdisk电极具有良好的电流响应，H2O2浓度在1～29 μmol/L范围内，电流响应与浓度呈现良好的线性关系（I （pA）=27.67-4.37CH2O2（μmol/L）， R=0.98），检出限为0.4 μmol/L（S/N=3）。Auring电极对DA也具有良好的响应，DA浓度在0.5～25 μmol/L，其电流响应值与DA浓度呈良好的线性关系（I （nA）=0.40 （nA）+ 0.45CDA （μmol/L）， R=0.99），检出限为0.18 μmol/L（S/N=3）。

进一步考察了环盘电极之间是否存在交叉干扰，结果如图5所示，当PBS溶液中加入20 μmol/L H2O2后，Auring电极上未出现明显的电流变化， 而PEDOT/PB/CFdisk电极上的电流则明显下降。加入图4 （A）在PBS溶液中连续加入一定浓度的H2O2后PEDOT/PB/CFdisk电极的电流响应图。电位：

0.05 Vvs. Ag/AgCl; （B）從图（A）中获取的电流信号值与H2O2浓度的线性关系; （C）在PBS中连续加入一定浓度的DA后Auring电极的电流响应及（D）从图（C）中获取的电流信号值与DA浓度的线性关系，电位： +0.3 V vs. Ag/AgCl

Fig.4 （A） Amperometric responses curve obtained at PEDOT/PB/CFdiskelectrode in the PBS upon successive addition of different concentrations of H2O2 （μmol/L） as labeled; （B） Linear curve of current responses obtained from （A） to the concentration of H2O2. Applied potential： -0.05 V vs. Ag/AgCl; （C） Amperometric responses curve obtained at Auringelectrode in the PBS upon successive addition of different concentrations of DA （μmol/L） as labeled. Applied potential： +0.3 V vs. Ag/AgCl; （D） Linear curve of current responses obtained from （C） to the concentration of DA10 μmol/LDA后，Au ring电极的电流出现了明显增加，而PEDOT/PB/CFdisk电极的电流未明显变化。

这些结果表明，PEDOT/PB/CFdiskAuring电极两个通道之间未交叉干扰，因此可用于MFB NAc脑区中H2O2和DA的同时检测。

利用计时电流法检测时，电极的稳定性也是活体分析要考虑的重点问题。如图6A所示，在2000 s内， PEDOT/PB/CFdisk电极能保持良好的稳定性。本研究采用溅射成膜方式形成的Auring电极，检测DA在2000 s内同样拥有良好的稳定性，这与文献[30]报道的金电极对DA检测具有良好的稳定性一致。

3.4 鼠脑内的H2O2和DA的活体检测

为了证明Auring电极能够用于实时监测活体内DA的变化，将环盘电极植入到SD大鼠的NAc脑图6 （A）在PBS溶液中加入10 μmol/L H2O2后的PEDOT/PB/CFdisk电极的电流响应图。电位： -0.05 V vs.Ag/AgCl; （B）在PBS溶液中加入10 μmol/L DA后的Auring电极的电流响应图。电位： +0.3 Vvs.Ag/AgCl

Fig.6 （A） Amperometric current response of （A） H2O2 （10 μmol/L） at PEDOT/PB/CFdiskelectrode in PBS and （B） DA （10 μmol/L） at Auringelectrode in PBS. Applied potential： -0.05 V vs.Ag/AgClat PEDOT/PB/CFdiskelectrode; +0.3 V vs. Ag/AgCl at Auringelectrode

区，并在MFB区域用双极电极进行电刺激（60 Hz，±300 μA，3 s）。如图7A所示，在刺激后，Auring电极上记录到短暂的脉冲式电流变化，

这种释放模式与文献[13，14]报道一致。但是，在刺激下未观察到H2O2浓度变化。为了考察PB/PEDOT/CFdisk电极能对H2O2具有响应，利用微灌注的方式，在微电极附近灌注H2O2（10 mmol/L），结果如图7B所示，灌注H2O2 100 s后，电流逐渐下降，并达到峰值; 停止灌注后，电流又恢复到基线值，说明PB/PEDOT/CFdisk电极对在活体内对H2O2也具有良好的响应。

4 结 论

制备了用于H2O2和DA检测的环盘微电极，此电极对H2O2和DA均有良好的电流响应和稳定性。PEDOT/PB/CFdisk电极和Auring电极之间未交叉干扰，可检测活体内H2O2和DA浓度的变化。虽然在电刺激的过程中未观察到二者浓度同时变化，但此方法可用于其它的生理或者病理过程中有关H2O2和DA浓度的变化，并促进与之相关的生理和病理的研究。

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In Vivo Electrochemical Detection

of Hydrogen Peroxide and Dopamine

ZHANG Shuai， FENG Tao Tao， ZHANG Li， ZHANG Mei Ning*

（Department of Chemistry， Renmin University of China， Beijing 100872， China）

Abstract Simultaneous analysis of hydrogen peroxide （H2O2） and dopamine （DA） in the central nervous system is of great significance and has great challenges. Herein， a ring disk microelectrode for simultaneous electrochemical analysis of H2O2 and DA was developed. To selectively detect H2O2， the carbon fiber disk （CFdisk） electrode in the middle of the ring disk microelectrode was electrochemically modified by Prussian blue （PB） and poly（2，3 dihydrothieno 1，4 dioxin） （PEDOT）. The Auringon the periphery of the ring disk microelectrode was used to detect DA. The ring disk microelectrode exhibited sensitive response to H2O2 （linearity range： 1-29 μmol/L） and DA （linearity range： 0.5-25 μmol/L） with a detection limit of 0.4 μmol/Land 0.18 μmol/L， respectively. The ring disk microelectrode was successfully used in measuring H2O2 and DA in rat brain. This method provided a new platform for the study of neurophysiology and pathology of H2O2 and DA.

Keywords Hydrogen peroxide; Dopamine; In vivo; Microelectrodes; Electrochemical analysis