温阳固本汤对糖尿病神经病变大鼠NGF及BDNF表达、脂代谢和坐骨神经超微结构的影响

暴 鹏,李 雪,孙丽莎,张晓冉,杨欣怡,李朝敏

(成都中医药大学附属医院内分泌科,成都 610075;*通讯作者,E-mail:Chenyi2006@163.com)

糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy,DPN)指在无其他疾病影响下,糖尿病患者发生与周围神经功能病变相关的临床症状和(或)体征,可导致患者感觉、运动以及自主神经功能异常,其中以感觉神经功能障碍最为严重[1],患者多表现为双侧肢体感觉功能异常,严重者甚至可导致肢体肌肉萎缩[2]。目前,DPN的发病机制尚未明确,尚缺乏针对性治疗方式。刘剑钢等[3]给予DPN患者补阳还五汤治疗,并且与西医常规治疗为对照组,研究结果表明中药方剂治疗效果明显优于对照组,且能够改善患者血液黏滞状态,提高患者脂质代谢功能,改善周围神经组织缺血缺氧状态,提高神经信号传导。薛铸等[4]采用黄芪桂枝五物汤治疗DPN患者,结果表明能够有效提高DPN患者的腓总神经传导。尚无温阳固本汤治疗DPN的相关报道。本研究探讨温阳固本汤对DPN大鼠NGF及BDNF表达、脂代谢和坐骨神经超微结构的影响,明确该方剂对DPN的保护作用及作用机制,为中医药治疗DPN提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

5-6周龄SPF级雄性SD大鼠60只,体质量180-220 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司(生产许可证:北京百善SCXK(京)2016-0006),饲养于成都中医药大学SPF级动物实验中心(设施使用许可证号:SCXK(川)2008-Ⅱ),温度18-26 ℃,相对湿度40%-70%。

1.2 温阳固本汤

温阳固本汤方剂为仙灵脾15 g、黄芪15 g、半枝莲15 g、丹参15 g、茯苓15 g、大黄(熟)10 g,白术10 g、制附子6 g、苏叶为6 g、熟地3 g、甘草3 g,由成都中医药大学附属医院中药房提供,水煎浓缩为生药量1.5 g/ml,分装后4 ℃保存备用,按各组所需浓度稀释后用于SD大鼠灌胃。

1.3 主要试剂

链脲霉素(STZ)购自华中海威(北京)基因科技有限公司,辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG购自碧云天生物技术有限公司,sc-2048 ECL试剂盒购自美国Santa cruz公司,NGF为兔来源的多克隆抗体(美国GeneTex公司),M-MLU反转录试剂盒(美国thermoscientific公司),real-time PCR扩增试剂盒购自上海索宝生物科技有限公司,BDNF为兔来源的多克隆抗体购自杭州华安生物技术有限公司,M-MLV反转录试剂盒购自solarbio公司,甘油三酯(TG)试剂盒、胆固醇(TC)试剂盒、高密度脂蛋白(HDL-C)试剂盒和低密度脂蛋白(LDL-C)试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司。

1.4 糖尿病大鼠模型制备

随机选取10只大鼠为对照组,其余50只大鼠禁食12 h,腹腔注射柠檬酸盐缓冲液(pH 4.2)配制的浓度为2%的链脲佐菌素(STZ)溶液,按60 mg/kg剂量腹腔注射;对照组大鼠腹腔注射等量柠檬酸盐缓冲液,腹腔注射造模后72 h,测定大鼠尾尖静脉血血糖,以多次随机尾尖血糖值不低于16.7 mmol/L为糖尿病大鼠模型造模成功标准[5]。

1.5 DPN大鼠模型制备

糖尿病大鼠继续饲喂维持期饲料4周,腹腔注射10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)麻醉大鼠,仰卧位固定。消毒备皮,沿右侧腹股沟作为2 cm长切口,钝性分离肌肉、血管,用动脉夹在腹股沟处夹闭股动脉;再于腹壁正中线作3 cm长切口,钝性分离肌肉、血管,于髂总动脉右侧分支约1 cm处夹闭血管,于髂腰动脉水平下约0.5 cm夹闭腹主动脉。无菌生理盐水纱布覆盖伤口,采用红外灯维持大鼠右后肢环境温度为35 ℃。术后第4天恢复右后肢血液供应,逐层缝合肌肉组织和皮肤。无菌辅料覆盖伤口且注意保持辅料清洁。术后连续3 d每只大鼠腹腔注射8万U/d青霉素预防感染。

1.6 分组与处理

手术造模后7 d,待大鼠伤口基本愈合后给予药物治疗。50只DPN模型大鼠随机分为模型组、阳性对照组、温阳固本汤低剂量组、温阳固本汤中剂量组及温阳固本汤高剂量组,每组10只。参考徐叔云教授主编《药理实验方法学》,温阳固本汤低、中、高剂量组按照成人剂量的6.25倍、12.5倍、25倍分别给予温阳固本汤9.17 g/kg、18.33 g/kg及36.67 g/kg灌胃,阳性对照组20 mg/kg α-硫辛酸灌胃,对照组和模型组等量生理盐水灌胃,1次/d,连续56 d。

1.7 血脂检测

灌胃8周后,10%水合氯醛按0.4 ml/100 g剂量腹腔注射麻醉大鼠,腹主动脉采血5 ml于含有7.5% EDTA的真空采血管中,4 ℃ 3 000 r/min离心10 min,分离血浆置于-80 ℃备用。血浆指标均严格按照试剂盒说明书检测。

1.8 坐骨神经超微结构观察

取血后取大鼠右侧后肢坐骨神经约0.5 cm,放入2.5%戊二醛固定,随后再使用四氧化锇染色、环氧树脂包埋、切片,行电子透射显微镜观察。

1.9 坐骨神经NGF、BDNF检测

取大鼠后肢坐骨神经置于液氮中保存备用。

NGF、BDNF表达水平检测:将大鼠右侧后肢坐骨神经从液氮中取出约0.5 cm,采用免疫组化法检测大鼠坐骨神经中NGF、BDNF表达水平的检测,操作过程均严格按照免疫组化法说明书操作要求。

NGF、BDNF的mRNA水平检测：将大鼠右侧后肢坐骨神经从液氮中取出，放入预冷的研钵中加入液氮进行快速研磨，然后将粉末装入预冷的EP管中，每管加入1 ml Trizol，用枪吹打数次，室温放置5 min。取提取的总RNA 2 μl逆转录，反应体系为3 μl RNA、1 μl Oligo(dT)、9.5 μl ddH2O，反应体系先于70 ℃孵育5 min，0 ℃冰水浴后离心加入5 μl 5XBuffer、5 μl dNTP(10 mmol/L)、0.5 μl(Ribonuclease inhibitor)及1 μl M-MLV RT混合液，离心混匀先42 ℃孵育60 min，后70 ℃孵育10 min；冰上分装，-20 ℃保存cDNA。采用合成的cDNA第一条链为模板进行PCR，NGF、BDNF反应条件：预变性94 ℃，2 min，(94 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s；72 ℃ 10 min)40个循环，设立无模板对照和RT阴性对照。

NGF上游引物:5′-CACTCTGAGGTGCATAGCGT-3′,下游引物:5′-GCTTCAGGGACAGAGTCTCC-3′。BDNF上游引物:5′-CTGGATGAGGACCAGAAGGT-3′,下游引物:5′-CAGAAAGAGCAGAGGAGGCT-3′。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 造模结果

对照组SD大鼠无死亡,DPN模型大鼠死亡4只,即模型组死亡3只,温阳固本汤低剂量组死亡1只,模型大鼠符合要求者进入实验组,排除RNA提取不合格者,则最终对照组大鼠10只,模型组大鼠6只,温阳固本汤低剂量组8只,温阳固本汤中剂量组10只,温阳固本汤高剂量组9只。

2.2 大鼠血浆TG、TC、LDL-C、HDL-C含量

模型组大鼠血浆TG、TC、LDL-C含量明显高于对照组,HDL-C低于对照组(P<0.01);温阳固本汤中、高组血清TG、TC、LDL-C、HDL-C含量均明显低于模型组(P<0.01);温阳固本汤低剂量组TG、LDL-C、HDL-C含量均明显低于模型组(P<0.01);温阳固本汤低剂量组TC含量低于模型组(P<0.05,见表1)。

表1 大鼠血浆TG、TC、LDL-C、HDL-C含量(mmol/L)

Table 1 Contents of plasma TG, TC, LDL-C and HDL-C in rats after different treatment(mmol/L)

组别TGTCLDL-CHDL-C对照组0.35±0.071.61±0.220.52±0.171.92±0.05模型组2.73±0.85∗∗4.31±2.04∗∗2.77±0.83∗∗0.68±0.08∗∗阳性对照组0.88±0.46##3.48±0.621.06±0.43##1.58±0.16##温阳固本汤低剂量组0.95±0.56##3.01±0.75#1.21±0.52##1.27±0.12##温阳固本汤中剂量组0.86±0.45##2.14±0.22##0.81±0.15##1.12±0.12##温阳固本汤高剂量组0.80±0.12##2.13±0.12##0.60±0.22##1.04±0.09##

与对照组对比,**P<0.01;与模型组对比,#P<0.05,##P<0.01

2.3 大鼠神经NGF、BDNF的表达结果

与对照组对比,模型组NGF、BDNF表达水平明显降低(P<0.01);阳性对照组NGF水平高于模型组(P<0.05),BDNF水平显著高于模型组(P<0.01);温阳固本汤低剂量组BDNF水平显著高于模型组(P<0.01,见表2);温阳固本汤中、高剂量组NGF、BDNF表达水平明显高于模型组,且随剂量的增加表达水平不断升高(见图1,2)。

表2 大鼠坐骨神经NGF、BDNF的表达结果

Table 2 NGF and BDNF expression in sciatic nerves of rats

分组NGF平均光密度值BDNF平均光密度值对照组 99.73±10.61 126.60±28.66模型组 71.00±2.57∗∗ 29.70±11.14∗∗阳性对照组 94.90±22.77# 69.35±15.87##温阳固本汤低剂量组 63.94±7.18 79.46±16.95##温阳固本汤中剂量组107.32±18.00## 94.94±3.74##温阳固本汤高剂量组101.28±13.84## 101.93±7.22##

与对照组对比,**P<0.01;与模型组对比,#P<0.05,##P<0.01

A.对照组;B.模型组;C.阳性对照组;D.低剂量组;E.中剂量组;F.高剂量组图1 大鼠神经NGF的表达结果 (×400)Figure 1 NGF expression in sciatic nerves of rats by immunohistochemical staining under light microscopy (×400)

2.4 大鼠坐骨神经组织NGF mRNA、BDNF mRNA相对水平

模型组坐骨神经组织NGF mRNA、BDNF mRNA相对水平明显低于对照组(P<0.01);阳性对照组NGF mRNA表达水平高于模型组(P<0.05),BDNF mRNA明显高于模型组(P<0.01);温阳固本汤低、中、高剂量组NGF mRNA、BDNF mRNA相对水平均明显高于模型组(P<0.01,见表3)。

表3 大鼠坐骨神经组织NGF、BDNF mRNA的相对水平

Table 3 The mRNA expression of NGF and BDNF in sciatic nerve tissue of rats

分组〛NGF mRNABDNF mRNA对照组1.17±0.230.91±0.19模型组0.20±0.08∗∗0.22±0.07∗∗阳性对照组0.48±0.20#0.48±0.13##温阳固本汤低剂量组0.63±0.29##0.56±0.09##温阳固本汤中剂量组0.99±0.29##0.81±0.12##温阳固本汤高剂量组0.85±0.27##0.61±0.15##

与对照组对比,**P<0.01;与模型组对比,#P<0.05,##P<0.01

2.5 大鼠坐骨神经超微结构变化

正常组大鼠坐骨神经横切面图片显示神经髓鞘结果致密、完整、均匀,且呈现同心圆样明暗相间的板层结构,施万细胞结构完整,核大圆润,轴索内可见大量神经丝、微丝、微管及线粒体,各结构完整、排列规则(见图3A);模型组大鼠坐骨神经横切面图片显示神经髓鞘板层结构分离,各层间排列杂乱,层间可见大量空泡及裂隙,神经轴索萎缩,线粒体结构紊乱,施万细胞变性坏死(见图3B);阳性对照组大鼠坐骨神经横切面图片显示神经髓鞘空泡及裂隙数目降低,但板层结构紊乱未缓解,线粒体结构无恢复,镜下无正常施万细胞(见图3C);温阳固本汤低剂量组和中剂量组大鼠坐骨神经横切面图片显示神经髓鞘空泡及裂隙数目明显减少,髓鞘板层结构未恢复,镜下可见结构正常的线粒体、粗面内质网及施万细胞(见图3D、E);温阳固本汤高剂量组神经髓鞘结构恢复正常,且呈现同心圆样明暗相间的板层结构,镜下髓鞘空泡及裂隙较少,仅小部分线粒体、微丝、微管结构异常,施万细胞结构完整(见图3F)。

A.对照组;B.模型组;C.阳性对照组;D.低剂量组;E.中剂量组;F.高剂量组图3 大鼠神经组织超微结构 (×8 000)Figure 3 Ultrastructure of nerve tissues in rats (×8 000)

3 讨论

DPN为糖尿病患者最为多见的慢性并发症之一,在糖尿病患者中具有较高的发病率和致残率。《中国糖尿病神经病变诊疗规范》(2009年)表明:确诊为糖尿病的患者在其10年病程中,神经系统可随病程的不断增加出现不同程度的病变[6],对糖尿病患者的生活质量及预后造成严重危害。因此,寻找有效的防治措施对DPN患者或高危患者具有重要价值,也是现阶段内分泌领域研究的热点问题。

高血糖为DPN发生的核心环节,但对其发病机制尚未明确,研究认为DPN与糖脂代谢紊乱、氧化应激、神经因子缺乏及免疫功能异常等因素有关。美国糖尿病协会(American Diabetes Association,ADA)(2001年)大会McGarry提出DPN发病的“脂毒性”学说,该学说认为脂代谢异常是导致糖尿病及其并发症病理生理学改变的主要原因[7]。本研究结果表明,模型组大鼠血清TG、TC、LDL-C含量明显高于对照组,HDL-C低于对照组(P<0.01);温阳固本汤中、高组血清TG、TC、LDL-C、HDL-C含量均明显低于模型组(P<0.01);温阳固本汤低剂量组TG、LDL-C、HDL-C含量均明显低于模型组(P<0.01);温阳固本汤低剂量组TC含量低于模型组(P<0.05)。结果表明神经组织发生脂代谢异常时,对神经细胞及其结构和功能可能造成直接或间接影响。与对照组相比,模型组大鼠坐骨神经细胞的髓鞘、轴索均出现损伤,温阳固本汤各剂量组对髓鞘、轴索均有修复作用,但以高剂量组效果最好。有研究发现,高脂血症可导致机体细胞变性和促进血小板聚集,降低血液流速,从而导致微血管血栓的形成,引起神经细胞供血、供氧障碍,从而对神经细胞的结构和功能造成直接破坏[8]。大量研究发现,机体脂代谢功能紊乱,脂质过氧化物水平升高,从而促进ROS的大量产生,引起机体的氧化应激反应。神经细胞内膜氧化应激产生的ROS对神经组织具有直接损伤作用;ROS为一种氧化应激信号分子,ROS水平异常可刺激细胞内一系列氧化应激信号通路的激活,从而通过直接或间接作用,引起神经细胞的功能异常、微循环障碍等,使神经细胞或组织功能受损及缺乏营养支持引起神经细胞的坏死或凋亡,从而导致DPN[9-12]。Cameron等[13]研究发现,糖尿病患者血浆中LDL-C可被AGES修饰,形成为晚期糖基化终产物修饰的低密度脂蛋白(advance glycation end product of low density lipoprotein,AGE-LDL),AGE-LDL被吞噬细胞吞噬后可于血管壁聚集,并相互交联形成为分子量更大的AGEs,促进血管病变的进展。Tesfaye等[14]研究发现,糖化血红蛋白和LDL-C长期持续处于高水平状态,可导致糖尿病患者DPN发病率增加,提前发病时间。

NGF和BDNF为神经营养因子。NGF为多肽类物质,主要分布于交感神经元和部分感觉神经元分布的区域内的组织细胞,具有维持交感和感觉神经功能的作用;BDNF为脑源性神经营养因子,该因子主要由神经元细胞合成分泌,对神经细胞的分化、生长及维持神经元功能具有重要作用。Kobayashi等[15]对糖尿病患者血浆中枢神经营养因子特别是NGF研究发现,NGF缺乏为DPN发生的主要危险因素之一。高妍等[16]对糖尿病患者应用鼠神经生长因子联合胰岛素泵后血清Cys-C水平变化研究发现,NGF对周围神经具有显著的保护作用,且对感觉神经也具有较好的营养作用。Nitta等[17]和吕翠岩等[18]研究发现,糖尿病大鼠脑组织及坐骨神经中BDNF mRNA表达水平降低,同时还发现该因子受体和促进该因子分泌的NGF mRNA表达水平显著降低。Li等[19]对糖尿病大鼠进行研究,发现给予外源性BDNF能够有效降低体质量和血糖水平。沈祥峰等[20]对糖尿病大鼠给予不同浓度的运脾和络颗粒灌胃干预,结果表明高糖条件下周围神经组织中的BDNF表达水平降低,使得受损神经纤维的修复明显减缓。本研究采用免疫组织化学法和real-time PCR法检测大鼠坐骨神经组织中NGF、BDNF、NGF mRNA和BDNF mRNA的表达水平,研究结果表明,大鼠坐骨神经组织中的NGF、BDNF、NGF mRNA和BDNF mRNA表达水平均存在显著降低,中药方剂温阳固本汤能够有效提高DPN大鼠NGF、BDNF、NGF mRNA和BDNF mRNA的表达。由此说明,中药方剂温阳固本汤对DPN的保护作用可能与促进NGF、BDNF、NGF mRNA和BDNF mRNA的表达有关。

综上所述,中药方剂温阳固本汤可降低DPN大鼠血脂水平,促进NGF、BDNF、NGF mRNA和BDNF mRNA的表达,该方剂对糖尿病周围神经的保护作用可能是通过降低血脂水平,增加NGF、BDNF、NGF mRNA和BDNF mRNA表达量有关。