复方黄芪益气口服液对AFB1所致大鼠急性肝损伤的保护作用

严文瑞,王玲芝,2,候玲玲,张立伟*

(1化学生物学与分子工程教育部重点实验室,山西大学分子科学研究所,太原 030006;2山西大学化学化工学院;*通讯作者,E-mail:lwzhang@sxu.edu.cn)

黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是由黄曲霉菌寄生曲霉菌等产毒菌株所产生的次级代谢产物,毒性是氰化物的10倍、砒霜的68倍,短期暴露可引起人体及动物肝细胞坏死、中毒性肝炎、胆管增生、免疫抑制等急性肝损伤,长期暴露会引发肝癌[1]。在温热潮湿的地区一些粮食及其加工产品,主要是稻谷、玉米、豆类等含水量高的作物及其粮油制品AFB1污染严重,对人和动物的健康造成了极大的危害[2]。我国南方由于地处湿热地带,AFB1污染十分严重,如何减少和消除AFB1对人和动物造成的危害是当今的一大难题[3]。

复方黄芪益气口服液是以黄芪为君药,佐以党参、大枣、甘草,采用现代制剂工艺和技术制成的口服剂。黄芪是山西的道地药材,其药用迄今已有2 000多年的历史,能增强机体的免疫功能[4]。已有研究表明,黄芪多糖可用来治疗AFB1诱发的肝损伤,具有显著的抗氧化及脂质代谢调节作用[5],黄芪甲苷也具有增强免疫力和保护肝脏的作用[6],为本课题提供了理论依据。本课题组前期研究表明,复方黄芪益气口服液具有提高免疫、抗应激、抗氧化等功能[7],临床用于气虚、血虚、气血两虚的病人,对体力恢复、症状改善有明显的疗效[8]。然而,目前尚无其对AFB1造成肝损伤的保护和治疗作用的研究报道,因此,本研究探讨复方黄芪益气口服液对AFB1造成的大鼠急性肝损伤的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性Wistar 6周龄大鼠40只,SPF级,体质量200-220 g,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司,许可证号:SCXK-(京)2016-0002。动物实验环境:山西省医药与生命科学研究院清洁级动物实验室,设施使用许可证号SYXK(晋)2017-0001,由获得资格认可的人员饲养,12/12 h照明/黑暗。大鼠在清洁干燥的标准饲养盒内喂养;动物房温度控制在(23±1)℃,湿度控制在50%±10%。饲料为灭菌全价大鼠颗粒饲料,饮用过滤纯净水。

1.2 药物及试剂

复方黄芪益气口服液(本实验室制备,黄芪、党参、大枣和甘草四味水煎)。AFB1标准品(纯度>99%,新加坡);水飞蓟宾(批号:YS8031503,编号:CV98613-1g,上海思域化工科技有限公司);谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒(南京建成生物工程有限公司);二甲基亚砜(DMSO,批号20161008,天津市大茂化学试剂厂);大笨钟特级初榨橄榄油(中欧天然食品股份有限公司)。

1.3 主要仪器

全自动生化分析仪,金西盟(北京)仪器有限公司(中国总公司);FM200A高剪切分散乳化机,上海弗鲁克科技发展有限公司;FA-B型电子分析天平,上海右科仪器仪表有限公司。

1.4 造模及分组

大鼠适应性饲养5 d,随机分为5组:空白组、溶剂对照组(DMSO组)、模型组、阳性药物对照组(阳性对照组)、复方黄芪益气口服液组(口服液组),每组8只:大鼠分组后禁食过夜,称重,模型组、阳性对照组、口服液组大鼠以2 mg/kg的AFB1(溶于12.5% DMSO水溶液中)单剂量灌胃以诱导急性AFB1肝损伤,空白组给予等量的水,DMSO组给予等量的DMSO。以AFB1灌胃造模的同时,阳性对照组给予100 mg/kg水飞蓟宾(溶于橄榄油中),口服液组按照人临床服用标准换算剂量为2 ml/kg复方黄芪益气口服液,DMSO组、模型组和空白组灌胃等量的水,每日1次,持续3 d。给药3 d禁食过夜,称取大鼠体质量,麻醉后迅速腹腔主动脉取血,离心,取血清-20 ℃保存;取肝脏,生理盐水清洗后吸干称重;取适当大小肝组织浸泡在甲醛溶液中,充分固定后用于组织病理学观察,其余肝组织于液氮冷冻后,-80 ℃保存。

1.5 肝指数检测

取出肝脏后迅速称量肝湿重,肝指数=(肝湿重/体质量)×100%。

1.6 肝组织病理学变化观察

肝组织在甲醛溶液中充分固定,常规石蜡包埋、切片,苏木素染色,光学显微镜观察肝组织结构及其病理变化。

1.7 血清肝功能指标测定

腹主动脉取血,3 000 r/min,4 ℃离心10 min分离血清,用于全自动生化分析仪检测ALT、AST和ALP活性及TBIL含量。

1.8 肝组织抗氧化指标测定

准确称取肝组织,解冻后加入9倍体积预冷生理盐水,迅速用电动分散机匀浆,于4 ℃,2 500 r/min,离心10 min,取上清即为待测肝脏匀浆。按试剂盒说明检测肝脏匀浆总蛋白含量和抗氧化指标MDA、SOD、CAT和GSH-PX含量。

1.9 统计学分析

用SPSS 19.0软件对各组数据进行处理,以单因素方差分析进行显著性比较,数据以均值±标准差表示,P<0.05为差异具有统计学意义,用GraphPad Prism 5作图。

2 结果

2.1 大鼠健康状况

实验期间无大鼠死亡,空白组和DMSO组大鼠食欲良好,毛色正常,周身顺滑有光泽,反应敏捷,行为迅速;模型组大鼠食欲减退,精神不振,毛色黯淡,活跃度下降;阳性对照组和口服液组较模型组状况有所改善。

2.2 肝肉眼观察变化

空白组与DMSO组肝脏表面呈现正常的暗红色;模型组肝脏发黄,表面有轻微出血点;阳性对照组和口服液组肝脏轻微发黄,表面无出血点,较模型组有所改善。

2.3 复方黄芪益气口服液对大鼠体质量和肝指数的影响

由表1可知,实验前各组间大鼠体质量不存在显著差异,实验处理3 d,除空白组和DMSO组外,其余组大鼠体质量增长缓慢甚至负增长,空白组与模型组有显著性差异(P<0.05),说明AFB1会抑制大鼠体质量增长;阳性对照组、口服液组的体质量增长量较模型组有所改善,但效果不明显,其原因可能与实验天数短有关。

表1 复方黄芪益气口服液对大鼠体质量的影响

(n=8,g)

Table 1 Effect of Fufang Huangqi Yiqi oral liquid on body weight in AFB1-treated rats(n=8,g)

动物分组实验前体质量实验后体质量体质量增长量 空白组235.8±11.4259.4±11.723.56±3.64 DMSO组236.4±7.5260.8±7.624.33±5.02模型组238.4±8.7236.5±9.3#-1.9±8.87#阳性对照组236.9±8.5235.4±14-0.3±9.35口服液组235.1±4.2237.8±8.22.6±6.92

与正常组比较,#P<0.05

由图1可见实验处理3 d,模型组与DMSO组、空白组比较,肝指数明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。阳性对照组、口服液组与模型组相比肝指数明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 大鼠肝组织病理学变化

对大鼠肝组织病理学变化进行观察,空白组和DMSO组大鼠的肝组织结构正常,肝小叶清晰且结构完整;肝细胞多呈多边形,以中央门静脉为中心呈放射状整齐排布,胞质均匀,细胞核位于细胞中心呈圆形,核仁清晰,无明显异常变化(见图2)。模型组大鼠的肝组织结构异常,肝小叶结构不完整;肝细胞明显肿胀,大量变性甚至坏死;汇管区有严重胆管增生且伴有炎细胞浸润,汇管区明显增宽(见图2)。阳性对照组大鼠的肝组织结构较正常组有所改善,肝细胞肿胀程度减轻,炎症浸润现象显著减轻,但仍可见不同程度的病变(见图2)。复方黄芪益气口服液干预后的肝组织切片显示,大鼠的肝组织基本恢复至正常,肝细胞索排列规则,且没有出现肝细胞变性、肿胀及汇管区炎症浸润等现象无明显异常变化(见图2)。

与正常组比较,#P<0.05;与模型组比较,*P<0.05图1 复方黄芪益气口服液对大鼠肝指数的影响Figure 1 Effect of Fufang Huangqi Yiqi oral liquid on liver index in AFB1-treated rats

图2 肝组织病理学形态变化 (×200)Figure 2 Pathological changes of liver tissue in different groups (×200)

2.5 复方黄芪益气口服液对大鼠血清肝功能生化指标的影响

对大鼠血清ALT、AST、ALP和TBIL使用试剂盒进行测试,结果见图3。模型组大鼠血清ALT、AST、ALP和TBIL明显高于空白组和DMSO组,差异有统计学意义(P<0.05),这与肝指数和肝脏病理切片的结果相符。与模型组比较,阳性对照组和口服液组明显抑制了AFB1引起的血清肝功能生化指标的急剧升高,差异有统计学意义(P<0.05),其中ALP基本恢复至正常水平。

与正常组比较,#P<0.05,##P<0.01;与模型组,*P<0.05,**P<0.01图3 复方黄芪益气口服液对大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL的影响Figure 3 Effect of Fufang Huangqi Yiqi oral liquid on serum ALT, AST, ALP and TBIL in AFB1-treated rats

2.6 复方黄芪益气口服液对大鼠肝脏脂质过氧化的影响

肝脏MDA含量可间接反映机体脂质过氧化严重程度及细胞受损情况,可以作为评价复方黄芪益气口服液抑制AFB1诱发大鼠肝脏脂质过氧化反应的指标。模型组大鼠摄入高剂量AFB1会导致大鼠肝脏脂质过氧化产物MDA含量显著上升(P<0.01,见图4),口服液组MDA含量极显著低于模型组(P<0.01),与阳性对照组相当且恢复到正常水平。

与正常组比较,#P<0.05,##P<0.01;与模型组,*P<0.05,**P<0.01图4 复方黄芪益气口服液对大鼠肝脏中MDA含量的影响Figure 4 Effect of Fufang Huangqi Yiqi oral liquid on the level of MDA in liver tissues of AFB1-treated rats

2.7 复方黄芪益气口服液对大鼠肝组织抗氧化指标的影响

肝组织中CAT、SOD、GSH-PX的活性水平可以直接反应肝脏的抗氧化能力,可作为评价复方黄芪益气口服液提高AFB1诱发大鼠肝脏抗氧化应激损伤的指标。由图5可知,模型组与DMSO组、空白组比较,肝组织中CAT、SOD、GSH-PX活性显著降低(P<0.05);连续服用复方黄芪益气口服液3 d,口服液组与模型组相比大鼠肝脏中CAT、SOD、GSH-PX活性明显增强,其中SOD和GSH-PX都恢复到了正常水平,CAT活力显著改善(P<0.05)。

3 讨论

肝脏是AFB1的主要靶器官,AFB1暴露会引起肝脏和肝细胞的严重受损,肝脏受损表现为肝指数降低[9],本实验中复方黄芪益气口服液的干预可以抑制肝指数的降低;肝脏受损病理表现为胆管增生,肝小叶结构紊乱,肝细胞索不明显,肝细胞坏死,崩裂,细胞组织结构消失[10]。本实验AFB1干预的肝脏病理观察结果与上述表现相符,而用复方黄芪益气口服液治疗的大鼠肝脏病理切片显示肝细胞损伤显著改善,出现修复性病灶。肝细胞受损表现为细胞膜通透性增加,ALT和AST通过细胞膜进入血液,使得血清中ALT和AST急剧增加,故血清ALT和AST水平的高低是反映肝细胞损伤程度的特异性指标[11]。在本实验中,大鼠服用AFB1后,ALT和AST含量显著升高,而用复方黄芪益气口服液干预的大鼠血清中ALT和AST水平显著降低,这表明复方黄芪益气口服液能够起到干预AFB1所致肝损伤的作用。肝脏的病理性损伤也会引起ALP和TBIL的异常升高,复方黄芪益气口服液干预的大鼠ALP和TBIL显著降低,这进一步表明复方黄芪益气口服液能够起到干预AFB1所致肝损伤的作用。

与正常组比较,#P<0.05,##P<0.01;与模型组,*P<0.05,**P<0.01图5 复方黄芪益气口服液对大鼠肝脏中SOD、CAT、GSH-PX含量的影响Figure 5 Effect of Fufang Huangqi Yiqi oral liquid on the levels of hepatic SOD, CAT and GSH-PX in AFB1-treated rats

AFB1致肝损伤的发病机制与氧化应激密切相关,肝脏酶系在代谢过程中生成大量自由基,AFB1会导致自由基介导损伤,主要表现就是脂质过氧化;还会导致细胞抗氧化酶水平降低,引起机体氧化应激损伤[12,13]。MDA是脂质过氧化过程中的重要产物,它反映了体内脂质过氧化的氧化程度和细胞遭受自由基损伤的程度;SOD为最重要的抗氧化酶之一,有着防止细胞氧化损伤的作用;GSH-PX、CAT能够间接地反映机体细胞受自由基攻击的严重程度[14,15]。本实验结果显示,复方黄芪益气口服液可显著降低大鼠肝组织MDA水平,同时显著提高肝组织CAT、SOD和GSH-PX水平,提示复方黄芪益气口服液含有抗氧化的活性物质和具有提高体内抗氧化酶活力的作用。即复方黄芪益气口服液可能通过提高大鼠机体的抗氧化能力,发挥治疗AFB1所致肝损伤作用。

综上所述,复方黄芪益气口服液能有效抑制AFB1引起的大鼠肝指数下降,改善肝组织病理性损伤,降低血清ALT、AST、ALP活力及TBIL水平,改善肝组织病理变化,减轻大鼠肝脏脂质过氧化水平,并显著提高肝脏SOD、CAT及GSH-Px活力。研究结果提示,复方黄芪益气口服液具有保护肝组织和治疗AFB1所致肝损伤的功能。