沉默BCRP表达抑制乳腺癌细胞对阿霉素耐药的机制研究

马海琳,车少敏,王晓丽,张晓智

(西安交通大学第一附属医院肿瘤放射治疗科,西安 710061;*通讯作者,E-mail:mhl7906@163.com)

乳腺癌(breast cancer,BC)发病率为全球恶性肿瘤第2位,是导致癌症死亡的第5大主要原因;2018年全球癌症数据显示,在女性恶性肿瘤中,乳腺癌发病率、死亡率均居首位[1]。我国是乳腺癌高发国家,2018年国家癌症中心发布数据显示,在女性恶性肿瘤中,乳腺癌发病居首位,城市高于农村,并呈现逐年增加趋势[2]。目前,乳腺癌的治疗以手术、放疗、化疗、内分泌治疗靶向治疗及免疫治疗[3]等手段为主。化疗在乳腺癌综合治疗中的作用尤为重要,特别是晚期乳腺癌和三阴乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC);但多药耐药(multi-drug resistance, MDR)常导致化疗抗拒,致乳腺癌复发和转移,限制了乳腺癌有效治疗。研究表明MDR是一个极其复杂且不断变化的过程,是多基因、多因子共同参与,并通过多途径来完成的。克服MDR的方法包括使用逆转剂、基因调控技术等。

乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)是分子量为72 kD的跨膜蛋白,其基因定位于4q22.23,全长66 kb,编码基因为ABCG2[4]。BCRP属ATP结合盒(ABC)膜转运蛋白超家族,其耐药机制与P-gp相似,通过水解ATP供能将抗肿瘤药物逆浓度梯度由细胞内转运出胞外,从而使胞内药物浓度降低;研究发现,BCRP特异性使乳腺癌细胞对多种抗肿瘤药物抵抗,如阿霉素、米托蒽醌、拓扑替康等[5,6]。本研究探索沉默BCRP基因能够提高乳腺癌MCF-7/ADR细胞对阿霉素的药物敏感性及其分子机制,针对BCRP基因合成BCRP siRNA,转染乳腺癌细胞,分别用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测乳腺癌细胞BCRP mRNA及蛋白表达变化,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,观察RNA干扰BCRP基因对乳腺癌细胞多药耐药的影响;并用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测p53、Bcl-2及PKC表达来研究多药耐药分子机制。

1 材料和方法

1.1 细胞株及主要试剂

乳腺癌MCF-7/ADR细胞由西安交通大学医学部教育部环境与基因相关疾病重点实验室提供。SYBRR Premix Ex TaqTMkit,TaKaRa Ex Taq HS(TaKaRa,中国),RPMI1640培养基和胎牛血清(GIBCO,USA),Annexin Ⅴ-PI凋亡试剂盒(BD Bioscience,USA),ECL化学发光底物试剂盒(Pierce,USA),TRIzol Reagent(Invitrogen,USA);HRP标记抗小鼠IgG(KPL,USA);兔单克隆anti-BCRP,兔单克隆anti-β-Actin(Santa Cruz,CA,USA);兔单克隆anti-p53,兔单克隆anti-Bcl-2,兔单克隆anti-PKC(Cell Signaling, Danvers, MA, USA)。

1.2 主要仪器

二氧化碳培养箱Galaxy S(英国RS Biotech),FASCalibar流式细胞仪(FALS CALIBAR BD),高通量多功能微板测试系统(德国MG Labtechnologies),倒置相差显微镜(OLYMPUS,Japan),PCR仪(PTC-100)(MJ Research,USA),iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System(BioRad,USA),湿法蛋白电转印系统DYCZ-40D(北京六一仪器厂)。

1.3 细胞培养

常规复苏液氮冻存的乳腺癌MCF-7/ADR细胞,用含10%胎牛血清及双抗(链霉素、青霉素)的RPMI1640培养基,在37 ℃、5% CO2培养,在细胞密度为80%、处于对数生长期时传代;2 d更换培养液1次,每日观察细胞生长情况变化;细胞处于对数生长期、细胞状态良好时进行实验。

1.4 siRNA的设计、合成及转染

siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成,序列见表1。转染前将Lipofectamine2000与相应剂量的基础培养液混合,室温孵育5 min;将siRNA与相应剂量的基础培养液混合,室温孵育5 min;再将前两者混合,室温孵育15 min,将siRNA-Lipofectamine2000混合物加入培养板转染,继续培养至收获时间。

表1 BCRP siRNA序列

Table 1 The sequences of BCRP siRNA

1.5 MTT比色法分析实验

实验分正常对照组、阴性对照组(negative siRNA)、siRNA(50 nmol/L)组。转染siRNA后,再给各组加入阿霉素,浓度为25,50,100,200,400,800 ng/ml,空白孔加入完全培养基,加入药物后继续培养48 h。培养细胞在收获前4 h,每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液,于孵箱中培养至收获时间。每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液,继续孵箱中培养4 h;取出、弃上清,加入150 μl DMSO,震荡15 min,促使结紫色晶充分溶解。在POLARstar+OPTIMA微板测试仪上检测光吸收值,检测波长为490 nm,以只加培养液孔为空白对照组。各平行孔取均值后以下式计算细胞相对存活率。细胞相对存活率(%)=(OD实验组/OD对照组)×100%(以空白组OD值为零)。各组实验均重复3次。

1.6 细胞凋亡检测

细胞处理后培养、制备成浓度为1×105个/ml的悬浮细胞,向5 ml流式管中加入100 μl的细胞悬液,再向每管加入5 μl Annexin Ⅴ/FITC和5 μl 20 μg/ml的碘化丙锭,混匀后避光反应15 min;向避光反应完毕的样品中加入400 μl PBS。将处理完毕的样品,用FASCalibar流式细胞仪检测。

1.7 实时荧光定量PCR分析PKC、P53、Bcl-2 mRNA的相对水平

实验分为:对照组、阴性对照组、siRNA(50 nmol/L)组、阿霉素组(200 ng/ml)、siRNA+阿霉素组。各引物由TaKaRa公司设计与合成(见表2)。各实验组与细胞对照组之间目的基因扩增变化,通过根据公式Folds=2-ΔΔCt计算各检测目的基因的相对表达量。其中ΔΔCt=(Ct检测基因-Ctβ-actin)实验组-(Ct检测基因-Ctβ-actin)对照组。

表2 实时荧光定量PCR引物

Table 2 Primer sequences used for real-time quantitative PCR

1.8 免疫蛋白印迹分析PKC、P53、Bcl-2蛋白表达

细胞转染48 h时,RIPA裂解液裂解细胞,SDS-PAGE电泳完毕后,将蛋白转膜至PVDF膜,放入封闭缓冲液中室温封闭1 h,Rabbit monoclonal anti-BCRP(1 ∶2 000)、Rabbit monoclonal anti-p53(1 ∶1 000)、Rabbit monoclonal anti-PKC(1 ∶2 000)、Rabbit monoclonal anti-Bcl-2(1 ∶2 000)、Rabbit monoclonal anti-β-Actin(1 ∶5 000)一抗4 ℃孵育过夜，弃一抗、TBST 轻摇洗膜3次,加入HRP标记抗小鼠IgG二抗(1 ∶5 000),室温孵育2 h,弃二抗、TBST轻摇洗膜3次,ECL发光显色检测目的蛋白,实验以β-actin为内参。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 转染BCRP siRNA后MCF-7/ADR细胞中BCRP mRNA表达下调

实时定量PCR结果显示,与阴性对照组比较,转染BCRP siRNA实验组BCRP mRNA表达量显著降低至(30.5±9.2)%(P<0.01,见图1)。Western blot实验结果显示,转染BCRP siRNA后,其蛋白表达量明显下调(见图2)。

2.2 转染BCRP siRNA对MCF-7/ADR细胞增殖的影响

MTT实验结果显示,与阴性对照组比较,处理48 h和72 h时BCRP siRNA组、阿霉素组、BCRP siRNA+阿霉素组MCF-7/ADR细胞的增殖能力均显著降低;与阿霉素组比较,BCRP siRNA+阿霉素组MCF-7/ADR细胞的增殖能力显著降低(P<0.01,见图3)。

与阴性对照组比较,*P<0.01图1 转染BCRP siRNA后乳腺癌MCF-7/ADR细胞中BCRP mRNA表达变化Figure 1 The changes of BCRP mRNA expression after transfection with BCRP siRNA in MCF-7/ADR cells

1.空白对照;2.阴性对照;3.BCRP siRNA图2 转染BCRP siRNA后乳腺癌MCF-7/ADR细胞中BCRP蛋白表达变化Figure 2 The changes of BCRP expression after transfected with BCRP siRNA in MCF-7/ADR cells

同时点与阴性对照组比较,*P<0.01;同时点与阿霉素组比较,#P<0.01图3 转染BCRP siRNA对MCF-7/ADR细胞增殖的影响 (MTT比色分析)Figure 3 Effect of BCRP siRNA on MCF-7/ADR cell proliferation by MTT assay

2.3 转染BCRP siRNA对MCF-7/ADR细胞凋亡的影响

流式细胞术检测细胞凋亡实验结果显示,阴性对照组早期凋亡细胞为(6.16±0.5)%;晚期凋亡细胞为(2.32±0.39)%。与阴性对照组相比,BCRP siRNA+阿霉素组早期凋亡细胞显著增加,为(28.67±5.28)%(P<0.01);晚期凋亡细胞也增加,为(20.39±3.49)%(P<0.01,见图4,5)。

与阴性对照组比较,*P<0.01;与阿霉素组比较,#P<0.01图4 转染BCRP siRNA对MCF-7/ADR细胞凋亡的影响Figure 4 Effect of BCRP siRNA on apoptosis of MCF-7/ADR cells

图5 流式细胞仪检测细胞凋亡Figure 5 Cell apoptosis of MCF/7/ADR cells by flow cytometery

2.4 转染BCRP siRNA对MCF-7/ADR细胞PKC、p53、Bcl-2的影响

通过real time PCR检测各组细胞BCRP信号转导通路PKC活性及细胞凋亡相关基因p53、Bcl-2的表达变化,结果见图6。与阴性对照组和阿霉素组比较,BCRP siRNA+阿霉素组BCRP mRNA表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);PKC mRNA表达也均显著降低(P<0.01);p53 mRNA表达均显著增高(P<0.01);Bcl-2 mRNA表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.01,见图6)。

2.5 沉默BCRP对PKC、p53、Bcl-2蛋白表达的影响

Western blot实验结果显示,与阴性对照组比较,BCRP siRNA组、阿霉素组、BCRP siRNA+阿霉素组BCRP、PKC、Bcl-2蛋白表达量均下调,而p53蛋白表达量上调;与阿霉素组比较,BCRP siRNA+阿霉素组BCRP、PKC、Bcl-2蛋白表达量均下调,而p53蛋白表达量上调(见图7)。

与阴性对照组比较,*P<0.01;与阿霉素组比较,#P<0.01图6 转染BCRP siRNA后MCF-7/ADR细胞中BCRP、PKC、p53、Bcl-2 mRNA表达变化Figure 6 The changes of BCRP, PKC, p53, Bcl-2 mRNA expression after transfection with BCRP siRNA in MCF-7/ADR cells

3 讨论

BCRP是在乳腺癌细胞系MCF7/AdrVp中发现的耐药蛋白[7],基因位于4q22-23,编码665个氨基酸残基,包括16个外显子和15个内含子,转录起始位点在第二个外显子上[8];BCRP以二硫键连接形成同源二聚体或异二聚体的跨膜通道发挥作用。Maliepaard等[9]用抗BCRP单克隆抗体BXP-21、BXP-34研究发现,BCRP主要分布于细胞膜,在乳腺小叶、乳管、静脉和毛细血管内皮中均有表达。在特定环境下,BCRP可从胞膜向胞质移位,即BCRP的胞质限制。研究证实BCRP参与干细胞生理功能维持、激素分泌、叶酸稳态维持、卟啉和亚铁血红素代谢等生理过程[10];亦可识别、转运抗肿瘤药物,降低胞内药物浓度和减轻细胞毒作用,如米托蒽醌、伊立替康、甲氨蝶呤、拓扑替康、喜树碱等[11];BCRP过表达可致肿瘤细胞系对多种抗肿瘤药物如阿霉素、柔红霉素等交叉耐药[12]。研究发现,其对靶向药物产生类似的作用;Galetti等[13]实验结果显示,BCRP过表达干扰Gefitinib的吸收与转运;Kort等[14]报道BCRP可加速Ceritinib的代谢与清除,最终降低其效能。曾爱华等[15]发现BCRP基因在乳腺癌组织中阳性表达率、表达水平均高于癌旁组织,有淋巴结转移者表达水平显著升高;Okamura等[16]发现BCRP在肺癌组织中也广泛表达,其过表达与肺癌预后、肺癌细胞MDR相关。Xie等[17]发现RNAi抑制人绒毛膜癌细胞中BCRP表达后化疗药物敏感性增加;杨成等[18]发现RNAi抑制BCRP基因转录和翻译水平的表达,能明显提高MCF-7/ADR对阿霉素的药物敏感性。Jiao等[19]发现RNA-miR-181a、487a靶向抑制BCRP表达后,乳腺癌细胞对阿霉素、米托蒽醌等抗肿瘤药物敏感性增加。陈萍等[20]发现BCRP mRNA表达水平与腋淋巴结转移、Her-2等正相关,提示BCRP基因可预测乳腺癌侵袭转移,由此可判断乳腺癌生物学行为;Liang等[21]发现BCRP与肺癌的化疗耐受和预后密切相关。RNA干扰可在染色质水平、转录水平和翻译水平调控基因表达,有强的序列特异性和有效性;其机制主要是通过与mRNA的碱基完全互补配对,达到沉默靶基因的效应,是一种负调控机制。本实验通过实时荧光定量PCR和Western blot检测转染BCRP siRNA沉默BCRP,MCF-7/ADR细胞中BCRP mRNA和蛋白表达量均显著降低;MTT检测结果显示,沉默BCRP能抑制MCF-7/ADR细胞增殖能力;FCM结果显示,早期凋亡和晚期凋亡细胞数量均显著增加。我们的实验结果表明沉默BCRP提高乳腺癌MCF-7/ADR细胞对阿霉素的药物敏感性。因此,BCRP作为乳腺癌化疗耐药相关蛋白,并有可能成为潜在的生物标志物,为评估肿瘤疗效预测、预后等提供新的思路。

1.空白对照组;2.阴性对照组;3.BCRP siRNA组;4.阿霉素组;5.BCRP siRNA+阿霉素组;与阴性对照组比较,*P<0.01;与阿霉素组比较,#P<0.01图7 BCRP siRNA、ADM及两者合用对PKC、p53、Bcl-2蛋白表达的影响Figure 7 Effect of BCRP siRNA, ADM and their combination on protein expression of PKC, p53 and Bcl-2

蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是一种多功能蛋白,广泛参与细胞信号转导、蛋白质磷酸化、细胞对生长因子应答等生理生化过程,在肿瘤的发生、发展中起重要作用,参与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡和迁移,并且与肿瘤细胞MDR密切相关。p53基因是一种抑癌基因,定位于染色体17p13.1,基因全长约20 kb,编码393个氨基酸组成的53 kD的核内磷酸化蛋白,即p53蛋白;p53基因分野生型和突变型两种,具有高度的同源性和保守性。参与细胞周期调控、细胞分化与增殖、DNA修复、细胞凋亡等,并且具有抑制肿瘤血管生成的作用。目前在多种恶性肿瘤中均有研究,乳腺癌中p53的活化可抑制癌细胞增殖和促进凋亡[22,23]。细胞凋亡是一种程序化死亡过程,涉及多因素的调控,如Bcl-2蛋白质家族,包括抑制凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax等关键蛋白[24,25]。Bcl-2蛋白过表达使得肿瘤细胞逃避凋亡、抗肿瘤药物耐药;因此,采用RNAi等基因调控技术或Bcl-2抑制剂,如Venetoclax等[26,27]可能使Bcl-2蛋白过表达的恶性肿瘤细胞恢复正常的凋亡通路、克服凋亡抵抗,使得对传统化疗药物更敏感。本研究通过实时荧光定量PCR实验检测发现,沉默BCRP可使PKC、Bcl-2 mRNA表达均下调,而p53 mRNA表达上调;Western blot实验检测得知,PKC、Bcl-2蛋白表达量也显著下调,而p53蛋白表达量显著上调。因此,调控BCRP表达,通过调节PKC信号转导通路,抑制细胞增殖,调节Bcl-2与p53表达来促进细胞凋亡,为提高乳腺癌多药耐药的药物敏感性提供新的思路。

综上所述,沉默乳腺癌细胞中BCRP基因通过调控PKC、Bcl-2、p53表达抑制细胞增殖,诱导凋亡,从而提高乳腺癌MCF-7/ADR细胞对阿霉素的药物敏感性。本研究为BCRP在乳腺癌中的作用研究奠定了一定的实验基础,为乳腺癌多药耐药的临床应用提供新的实验依据。