miR-216b-5p在卵巢癌细胞系A2780中的表达及对增殖、迁移和侵袭的影响

黄 明,赵宗霞,2,葛俊丽,双 婷,陈必良*

(1空军军医大学西京医院妇产科,西安 710032;2西安医学院第二附属医院妇产科;3西安交通大学第一附属医院妇产科;*通讯作者,E-mail:cblxjh@fmmu.edu.cn;#共同通讯作者,E-mail:shuangting87@163.com)

卵巢癌(ovarian cancer)是最常见的妇科恶性肿瘤之一,也是女性癌症中最致命的一种[1,2]。卵巢癌是世界上女性癌症相关死亡的第五大原因[3]。在过去几十年中,卵巢癌的5年生存率仅为28%-40%[4]。目前,临床上对于卵巢癌的标准治疗策略是减瘤手术,并辅以铂类化疗等[5],尽管大多数患者对初级联合治疗反应良好,但约有80%患者会在5年内复发[6]。卵巢癌起病隐匿,转移性强,预后极差,其不良预后主要与疾病的晚期诊断和恶性复发密切相关[6],所以如何提高卵巢癌的诊断及治疗水平至关重要。

microRNA(miRNA)是进化上保守的、长度为19至22个核苷酸的非编码RNA[7]。miRNA常通过与信使RNA(mRNAs)的靶位点结合,触发mRNA降解或翻译抑制,从而参与基因的表达和调控[8]。miRNA可参与机体多种生理和病理过程,如细胞增殖、细胞周期停滞、发育、代谢和肿瘤发生等[9,10]。大量研究表明,miRNA与癌症的进展密切相关,且它们可以被视为诊断性生物标志物和治疗靶标[9]。

miR-216b-5p的抑癌作用已在多种肿瘤组织中被研究证实[11-14]。然而,miR-216b-5p与卵巢癌的相关性仍然未知,本研究旨在研究miR-216b-5p在卵巢癌中的表达及其对卵巢癌细胞生物学功能的影响。

1 材料和方法

1.1 细胞系

正常卵巢细胞系(IOSE-80)及卵巢癌细胞系(A2780)购自苏州北纳创联生物技术有限公司并保存于空军军医大学第一附属医院妇产科实验室,且实验使用细胞系经支原体检测证实无支原体污染,与该公司提供支原体检测报告一致。

1.2 试剂

胎牛血清(FBS)、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)购自美国Gibco公司,胰蛋白酶消化液、1%结晶紫染色液购自北京索莱宝公司、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)购自美国Sigma公司,Trizol试剂、脂质体Lipofectamine3000 Reagent、Opti-MEM购自美国Invitrogen公司,PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)购自日本Takara公司,SYBRTMSelect Master Mix购自美国Thermo Fisher公司,细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)购自合肥biosharp公司,内参U6和miR-216b-5p特异性的qRT-PCR引物(各一组RT引物和一对qRT-PCR引物)、hsa-miRNA-216b-5p mimics、hsa-miRNA-216b-5p inhibitor及mimics NC、inhibitor NC均由广州锐博生物科技有限公司合成和纯化。

1.3 方法

1.3.1 细胞转染 将卵巢癌细胞A2780种植于六孔板中,37 ℃、5%CO2细胞培养箱内培养,至细胞融合度达70%时进行细胞转染。采用脂质体法转染细胞,转染mimics NC作为过表达的对照组,hsa-miR216b-5p mimics作为过表达组;转染inhibitor NC作为抑制对照组,hsa-miR216b-5p inhibitor作为抑制组。并使用相同体积的培养基转染Lipofectamine3000作为空白对照组(control组)。6-8 h后更换常规培养基,转染48 h后收集细胞并使用qRT-PCR检测miR-216b-5p的表达量以评价转染效果。

1.3.2 real-time quantitative PCR(qRT-PCR) PBS洗涤正常卵巢上皮细胞IOSE-80、卵巢癌细胞A2780及上述各组转染细胞,使用Trizol试剂提取细胞中总RNA,根据PrimeScriptTMRT Master Mix实验手册反转录出cDNA,并以该cDNA为模板,采用荧光染料法在Applied Biosystems 7500 Fast System PCR仪(ABI)上进行扩增检测,SYBRTMSelect Master Mix反应条件为:50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min,1个循环,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40个循环,实验对象分别设置3个复孔,其结果采用相对定量法2-ΔΔCt进行分析。

1.3.3 CCK-8法检测细胞的增殖能力 取处于对数生长期的细胞经胰蛋白酶常规消化、PBS洗涤,离心收集细胞沉淀,重悬细胞并计数细胞数目,以2×103个/孔将细胞种植于96孔板上,每孔按100 μl的体积上样,设置5个复孔,经0,24,48,72 h培养后,将10 μl CCK-8溶液加入每孔中,继续培养2 h后,在450 nm波长下用酶标仪测定各孔吸光值并计算各组均值,分析、记录实验结果。

1.3.4 细胞划痕实验 取处于对数生长期的细胞经胰蛋白酶常规消化、PBS洗涤,离心收集细胞沉淀,重悬细胞并计数细胞数目,取适量细胞悬液均匀接种于六孔板中,并加入培养基至1.5 ml/孔,将六孔板置于37 ℃、5%的CO2培养箱中进行培养,待细胞形态正常且细胞融合率达到70%左右时,弃去培养基并使用10 μl枪头比着消毒后的直尺均匀划线,用预冷的无菌PBS 1 ml轻轻洗涤处理孔3次,尽可能地洗掉划下的细胞,并进行拍照(0 h),加入含低血清的培养基继续进行培养,并于48 h重复洗涤、拍照及培养。

1.3.5 Transwell细胞侵袭实验 将无血清培养基和基质胶按照6 ∶1的比例配制适量体积的稀释液,取70 μl稀释液充分包被Transwell小室基底膜,置于细胞培养箱内4 h。取处于对数生长期且受饥饿处理12 h后的细胞,消化并重悬细胞,计数细胞数目,将适量上述细胞悬液均匀接种于小室中、使细胞数目约为每室1×105个,将小室置于24孔板中,小室下层加入0.5 ml含10%血清培养基,37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h,使用PBS洗涤并用4%的多聚甲醛溶液固定,加入结晶紫染液对细胞染色约30 min,洗涤、空气中自然干燥,显微镜下观察并拍照,分析、记录实验结果。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 miR-216b-5p在卵巢癌细胞A2780的表达

qRT-PCR结果表明,miR-216b-5p在卵巢癌细胞系A2780中的表达明显低于正常细胞系IOSE-80,且差异具有统计学意义(P<0.01,见图1),这提示miR-216b-5p可能在卵巢癌组织中发挥着重要的生物学功能。

与IOSE-80比较,**P<0.01图1 qRT-PCR验证miR-216b-5p在正常卵巢上皮细胞系IOSE-80及卵巢癌细胞系A2780中的表达Figure 1 The expression of miR-216b-5p in normal ovarian epithelial cell line IOSE-80 and ovarian cancer cell line A2780 by qRT-PCR

2.2 细胞水平验证过表达及抑制miR-216b-5p的表达量

在转染miR-216b-5p mimics组中,miR-216b-5p的表达量明显高于mimics NC组,且差异具有统计学意义(P<0.01,见图2),而转染miR-216b-5p inhibitor后miR-216b-5p的表达量明显低于inhibitor NC组(P<0.05,见图2)。

与mimics NC比较,**P<0.01;与inhibitor NC比较,#P<0.05图2 qRT-PCR检测A2780细胞中miR-216b-5p过表达及抑制效果Figure 2 Expression of miR-216b-5p in A2780 cells after overexpression and inhibition by qRT-PCR

2.3 miR-216b-5p对细胞增殖活性的影响

CCK-8结果表示,miR-216b-5p mimics组能显著抑制卵巢癌细胞的增殖活性,且在72 h相比于空白对照组和mimics NC组,差异具有统计学意义(P<0.001,见图3),反之,在72 h miR-216b-5p inhibitor组则能有效促进卵巢癌细胞的增殖活性(P<0.01,见图3)。

与mimics NC比较,***P<0.001;与inhibitor NC比较,##P<0.01图3 CCK-8检测不同miR-216b-5p表达水平对细胞活力的影响Figure 3 Effect of miR-216b-5p expression on cell viability by CCK-8 assay

2.4 miR-216b-5p对卵巢癌细胞迁移及侵袭能力的影响

结果表明,miR-216b-5p mimics组能明显抑制卵巢癌细胞的迁移及侵袭能力,且相比于mimics NC组,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.001,见图4),与此同时,miR-216b-5p inhibitor组较inhibitor NC组具有强的促迁移和侵袭能力(P<0.05,见图4),这在一定程度上提示,miR-216b-5p在卵巢癌组织中可能发挥着抑癌作用。

与NC比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001图4 划痕实验和Transwell侵袭实验检测miR-216b-5p的对卵巢癌细胞迁移、侵袭的影响Figure 4 Effect of miR-216b-5p on the migration and invasion of ovarian cancer cells by wound healing and Transwell assays

3 讨论

卵巢癌是全球所有女性生殖系统中最致命的癌症之一[15]。由于卵巢癌发病隐匿,缺乏有效的早期筛查手段,肿瘤恶性程度高、进展迅速等因素,致使卵巢癌患者治疗效果差。尽管外科技术、诊断方法和新的化疗方案等已取得了很大进展,但卵巢癌的治疗仍然是一个巨大挑战[16]。

miR-216b-5p已被证实是一种肿瘤抑制因子。Liu等[17]研究证实miR-216b可作为非小细胞型肺癌(NSCLC)中细胞增殖和侵袭的负调节因子,miR-216b能够抑制NSCLC的细胞增殖和侵袭;Wang等[12]也表示miR-216b通过靶向Forkhead Box M1抑制骨肉瘤细胞增殖,迁移和侵袭;也有研究报道miR-216b通过靶向HMGB1介导的JAK2/STAT3信号通路在结直肠癌中起肿瘤抑制剂的作用[18]。同时,有研究显示,miR-216b通过靶向人NSCLC中FOXM1的表达来抑制细胞增殖、迁移、侵袭和EMT(上皮间充质转化)[19]。Zheng等[20]表示miR-216b-5p/HOXA1轴可被长非编码RNA 00152调控进而促进宫颈癌细胞增殖。上述研究都说明miR-216b的肿瘤抑制作用。然而,miR-216b-5p与卵巢癌的相关性并未见报道。

本研究主要探讨了miR-216b-5p在卵巢癌细胞系A2780中的表达情况及其对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。首先验证了miR-216b-5p在卵巢癌细胞系A2780细胞较正常卵巢上皮细胞系IOSE-80中低表达,预示miR-216b-5p在卵巢癌发展中可能发挥抑癌基因的作用。然后进行细胞转染,分别过表达和抑制miR-216b-5p,通过CCK-8检测证实了过表达miR-216b-5p能抑制卵巢癌恶性增殖的生物学行为,抑制miR-216b-5p能增强卵巢癌恶性增殖的生物学行为;同时通过划痕实验和Transwell侵袭实验探究了miR-216b-5p对卵巢癌迁移和侵袭的影响,结果显示过表达miR-216b-5p能够显著抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力,抑制miR-216b-5p能够促进卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力。以上结果差异均具有统计学意义。

综上所述,miR-216b-5p对卵巢癌细胞活性、迁移和侵袭的恶性生物学进展起着重要的作用。我们的研究提示miR-216b-5p有望成为治疗卵巢癌的潜在生物学靶点,这将为卵巢癌的治疗提供新的思路与策略。然而,对于miR-216b-5p在卵巢癌中发挥的功能及其如何被调控的具体作用机制仍未阐明。目前,有学者提出外泌体介导的细胞间miRNA转移是细胞间信号传导的机制,并且已经提出外泌体相关miRNA作为多种人类疾病的潜在微创生物标志物[21]。我们将会结合该思路对miR-216b-5p的相关机制做进一步探讨和研究。