基于高通量测序分析急性白血病患者与健康人群口腔菌群结构的变化规律以及差异性

任 乐,李大旭,张 喆,徐纪茹

(1西安交通大学医学部基础医学院病原生物学与免疫学系,西安 710061;2西安交通大学第一附属医院口腔科;*通讯作者,E-mail:xujiru@xjtu.edu.cn)

白血病又称“血癌”,是一类多发于儿童,且恶性程度极高的血液疾病[1]。在我国,白血病的发病率大约为3/100 000,平均发病年龄小于30岁,且急性白血病发病率高于慢性白血病[2]。白血病按分型方式主要分为慢性髓细胞白血病(CML),慢性淋巴细胞白血病(CLL),急性髓细胞白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)等四种类型,且不同种类白血病的发病危险度和最佳的治疗方式都有不同。口腔感染是白血病患者在放化疗过程中常见的并发症之一。目前认为,由于机体抵抗力下降,或长时间大剂量使用抗生素,应用免疫抑制剂,白细胞较低等原因抑制了口腔的正常菌群,导致白血病患者口腔菌群失调,许多研究表明口腔菌群与白血病患者口腔局部感染性疾病及全身感染有密切关系。

1998年,Handelsman等[3]第一次提出了宏基因组概念,宏基因组是指环境中全部微生物DNA的总和,其中包括可培养及不可培养的微生物基因组。高通量测序技术,又可称为是二代测序技术(NGS),是指一种能在短时间内获得大量序列片段的DNA测序技术。其特点在于测序速度快、测序准确度高、测序通量高,与传统的Sanger测序相比,成本也大大降低。目前该技术广泛应用于微生物宏基因组分析、动植物基因组测序以及疾病诊断等领域。另外,原核生物的核糖体RNA有5S、16S和23S三种[4],其中16S rRNA(基因为16S rDNA)包括10个保守区域(conserved regions)和9个高变区域(hypervariable regions),其中高变区具有属或种的特异性,随亲缘关系不同而有一定的差异[5]。因此,16S rRNA被认为是最适于细菌系统发育和分类鉴定的指标;而且16S rRNA扩增子测序技术已成为研究环境样品中微生物群落组成结构的重要手段[2,6,7]。2012年,Diaz等[8]通过高通量测序对比了5名健康受试者唾液和口腔黏膜的细菌群落组成,结果发现受试者唾液基因组的微生物多样性低于口腔黏膜。

基于16S rRNA的高通量测序技术,以其测序速度快、测序准确度高、测序通量高等优点,目前已广泛应用于各领域微生物菌群结构分析中。本研究基于16S rRNA基因V4高变区的高通量测序技术完成对健康组、AML组和ALL组的口腔唾液微生物的测序,并用Uparse软件对样品的全部Effective Tags分类[7,8];用Mothur软件和SILV(http://www.arb-silva.de/)进行物种注释分析[9];用MUSCLE软件进行多序列对比;用Qiime软件计算Chao 1、Shannon、Simpson、ACE等指数;用R软件绘制PCA、PCoA和NMDS图[10],从而挖掘样品之间的物种组成差异。为深入了解口腔菌群与健康和疾病的关系提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 研究对象 研究对象来源于2014-2015年期间于西安交通大学第一附属医院血液科就诊的急性白血病患者60例,其中ALL患者10例、AML初期治疗患者19例、AML病情缓解患者18例、AML难治患者13例,同期纳入健康者14例作为对照组。确定急性白血病患者和健康志愿者的纳入和排除标准,采集受试者第二天晨起时第一口非刺性唾液1 ml。嘱受试者晚上睡觉前刷牙漱口,第2天晨起刷牙漱口之前将唾液收集入痰杯中盖好,实验人员在2 h内将其放入-80 ℃冰箱冻存,备用。参与研究的患者与志愿者均被告知了样品收集的目的。

口腔内不同解剖部位,微生物的组成结构不同,我们利用唾液进行口腔微生物的研究具有明显的优势,包括无创、易于收集储存、微量、操作方便快捷、反复操作,也容易被患者接受等。

1.1.2 纳入排除标准 实验组纳入标准:经实验室及临床检查诊断为ALL和AML的患者。排除标准:5年内被诊断为其他恶性肿瘤的患者;6个月内扁桃体或唾液腺有急性化脓性感染;1个月内使用过抗生素和微生态制剂;患有糖尿病、冠心病、肾脏疾病者等全身性疾病。

对照组纳入标准:1个月内无抗生素及微生态制剂使用史;无其他慢性病史健康者。

在前期处理的AML组、ALL组和健康组口腔菌群DNA样本中随机挑选12份(其中每组4份),交送于北京诺禾致源科技股份有限公司,对各微生物样本的16S V4区域扩增子测序分析。

1.2 方法

1.2.1 口腔微生物总DNA提取 应用DNeasy Blood & Tissue Kit提取细菌总DNA,操作根据试剂盒说明书进行。

1.2.2 细菌16S rDNA的扩增 PCR扩增:先用无菌水将基因组DNA稀释样品至1 ng/μl,然后采用细菌16S rRNA基因的通用引物[11]341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′),对V4目的区域进行扩增。PCR反应体系为30 μl。

PCR产物的混样和纯化:PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测;根据PCR产物浓度进行等量混样,充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,对目的条带使用Qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物。

1.2.3 生物信息学分析 测序得到的原始数据(raw reads),存在一定比例的干扰数据(dirty data),为了使信息分析的结果更加准确、可靠,首先对原始数据进行质控、过滤、去嵌合体,得到有效数据(clean reads)。然后基于有效数据进行OTUs(operational taxonomic units)聚类和物种分类分析,并将OTU和物种注释结合,从而得到每个样品的OTUs和分类谱系的基本分析结果。再对OTUs进行丰度、多样性指数等分析,同时对物种注释在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。最后在以上分析的基础上,可以进行一系列的基于OTUs、物种组成的聚类分析,PCoA、PCA和UPGMA聚类等统计比较分析,挖掘样品之间的物种组成差异。

2 结果

2.1 OTUs分析

利用Uparse软件(Uparse v7.0.1001,http://drive5.com/uparse/)在97%的相似度水平下对Clean Tags进行聚类。在构建OTUs的过程中,对各个样品的有效序列数,低频数的Tags和Tags注释数据等信息进行统计,12个样品共获得了6 100个OTU,样品ZC1、ZC2、ZC3、ZC4、AML1、AML2、AML3、AML4、ALL1、ALL2、ALL3、ALL4分别获得了355,377,747,1 005,330,338,387,630,332,360,862和337个OTU(见表1)。

表1 样本测序数据统计结果

Table 1 Bioinformatics analysis of 12 samples from healthy controls, AML patients and ALL patients

样本名称原始序列有效序列碱基数量(nt)序列长度(bp)有效率(%)OTU数ZC195 36892 01723 227 57825295.07355ZC296 81993 27423 547 88825295.03377ZC395 60491 25523 052 51125393.67747ZC454 67752 10313 156 89825393.181 005AML192 45289 19822 513 22625295.05330AML290 25486 91821 948 52725394.85338AML383 08180 30420 281 38025395.24387AML451 59548 65412 322 89525392.11337ALL195 34391 71423 161 73625394.86630ALL283 82880 47020 314 65925294.13332ALL373 15169 89117 640 05625293.61360ALL483 29280 57420 343 07425295.33862均数82 95579 69820 125 86925294.346 100

原始序列:测序得到的原始拼接序列;有效序列:过滤嵌合体后,最终用于后续分析的序列数;有效率:有效序列数与原始序列数的比值

通过稀释曲线可以评价急性白血病患者和健康者口腔微生物的测序深度,图1显示,随着测序深度的增加,所有样本在测序数量较少时,曲线呈显著上升趋势,随着序列数量增加,曲线上升逐渐趋向平和,最终各个样本的稀疏曲线均基本达到饱和状态,说明继续增加测序数量也只可能会产生少量的微生物种类,表明此次实验的测序深度已基本覆盖到样品中所有的物种,更多的数据量对于发现新的微生物物种贡献极小。整体来看,健康组较患者组的曲线高,说明前者比后者的微生物多样性要高。总之,测序深度能够较为准确地反映口腔微生物的多样性。

Rank Abundance曲线可同时直观反映样品所含物种丰富度和均匀度。图2结果显示,健康组3个样本在水平方向的跨度较大,在垂直方向的平滑度小,剩余患者组的各个样品在水平方向的跨度小,在垂直方向的平滑程度高,说明健康组较患者组口腔细菌的组成比较丰富,但物种的均匀度相较于后者要低。

为了比较样品间或组间OTU的差异,利用R语言软件对样品间或组间OTU进行Venn图分析(见图3)。由图3A可直观的看出ZC1、ZC2、ZC3和ZC4中高相似度的OTU有175个,分别占样品OTU的65.54%,63.41%,27.43%,18.94%;图3B中,AML1、AML2、AML3和AML4中高相似度的OTU有82个,分别占样品OTU的31.18%,30.48%,25.87%,13.02%;图3C中,ALL1、ALL2、ALL3和ALL4中高相似度的OTU有179个,分别占样品OTU的69.92%,59.47%,23.37%,57.37%;图3D中,ZC、AML组间高相似度的OTU有686个,分别占样品OTU的56.84%(ZC)和76.39%(AML);图3E中,ZC和ALL组间高相似度的OTU有720个,分别占样品OTU的59.65%(ZC)和83.53%(ALL);图3F中,AML和ALL组间高相似度的OTU有664个,分别占样品OTU的73.94%(AML)和77.21%(ALL);图3G中,ZC、AML、ALL组间高相似度的OTU有595个,分别占样品OTU的49.30%(ZC),66.26%(AML),69.19%(ALL)。

图1 各样本口腔微生物群落Alpha多样性指数稀释曲线Figure 1 Rarefaction curves of alpha diversity index of oral microbial community in each sample

图2 各样品口腔微生物群落的物种丰度曲线Figure 2 Species abundance curve of oral microbial community in each sample

2.2 物种注释

对各个样品进行物种注释的结果进行分析,发现在门(Phylum)分类水平上最大相对丰度排名前10的分别是厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、梭菌门(Fusobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、螺旋体菌门(Saccharibacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和螺旋体门(Spirochaetes)。其中,厚壁菌门在ALL组中的丰度最高,拟杆菌门在AML组中的丰度最高,变形菌门和放线菌门在ALL组中的丰度远低于其他两组,对应的物种相对分布柱形图见图4。

选取各个样本最大相对丰度排名前30的属(Genus)制作物种相对丰度分布柱形图,结果见图5。其中,相对丰度排名前10的属分别是链球菌(Streptococcus)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、普氏菌属7(Prevotella-7)、普氏菌属(Prevotella)、贫养菌属(Abiotrophia)、韦永氏球菌属(Veillonella)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、Prevotella-6、孪生球菌属(Gemella)、纤毛菌属(Leptotrichia)。其中,链球菌属在ALL中的丰度最高,奈瑟氏菌属在AML组中的丰度远高于其他组,贫养菌属(Abiotrophia)在ZC组中的丰度远低于其他组。

2.3 Beta多样性分析

依据热图颜色梯度的变化情况可以直观地看出两两样品间的差异性,结果见图6。ZC1、ZC2、ZC3、ZC4这4个样品之间,无论是加权(颜色呈现为淡黄色)还是非加权(颜色呈现为淡红色),均未呈现出深红色,说明健康组内样品口腔微生物存在一定程度的差异性。AML1、AML2、AML3、AML4这4个样品之间,无论是加权(颜色呈现为淡黄色)还是非加权(颜色呈现为橙红色),均未呈现出深红色,说明AML组内样品口腔微生物存在差异性。ALL1、ALL2、ALL3、ALL4这四个样品之间,无论是加权(颜色呈现为淡黄色)还是非加权(颜色呈现为橙红色),均未呈现出深红色,说明ALL组内样品的口腔微生物存在差异性。总之,三组内样品口腔微生物均存在不同程度的差异性,这可能与各个样本的个体差异性或饮食、生活习惯差异有关。

图3 各个样本组内及组间口腔微生物群落OTU数量比较的韦恩图Figure 3 Comparison of oral microbial communities in each sample group and between groups using Venn diagram

图4 门水平上各组样本口腔微生物群落中物种的相对丰度Figure 4 Relative abundance of species in oral microbial community of each group on the phylum level

图5 属水平上各组样本口腔微生物群落中物种的相对丰度Figure 5 Relative abundance of species in oral microbial community of each group on the genus level

方格中的数字代表两个样本间的相异系数;在同一个方格中,上下两个值分别代表unweighted unifrac(非加权)和weighted unifrac(加权)距离图6 各样本间口腔微生物群落的Beta多样性指数热图Figure 6 Beta diversity index heat map of oral microbial community among samples

采用主坐标分析(PCoA)的方法比较各样品及组间的差异性,图7中三种颜色代表三个分组,组间不同样本在图中均有标注,图上距离越近的样品,相似性越大。从图7可以看出无论是采用加权还是非加权的计算方法,各样品及组间口腔微生物均存在一定程度的差异性。

横、纵坐标为引起样品间差异的两个最大特征,以百分数的形式体现主要影响程度图7 各组样本间口腔微生物群落差异性的PCoA分析Figure 7 PCoA analysis of the difference of oral microbial community among groups

对UniFrac分析得到的距离矩阵,通过R语言工具采用加权配对平均法(UPGMA)对样品进行层次聚类,以判断组间物种组成的相似性(见图8),由图可看出,ALL组和ZC组聚集到同一个分支上,AML单独在一个分支上,这说明较AML组,ALL组与ZC组口腔微生物具有一定的相似性,AML组与ALL组、ZC组口腔微生物群落结构组成差异。

图9结果显示,ALL组、AML组、ZC组存在一定的距离,说明各组间口腔微生物的结构组成存在不同程度的差异性。且AML组距离ZC组的距离最远,ALL组次之,说明与ZC组相比,AML组口腔微生物群落结构组成与其存在显著差异,ALL组口腔微生物的结构组成差异性次之。

图中的0.01代表枝长;样品越靠近,枝长越短,说明两个样品的物种组成越相似图8 组间UPGMA聚类图Figure 8 UPGMA cluster diagram between groups

图中带颜色的点表示不同的样品,图中各个点分散排列,说明不同样品口腔微生物群落结构及组成存在一定程度的差异性图9 样本间口腔微生物的PCA分析图Figure 9 PCA analysis of oral microbes between samples

3 讨论

目前已鉴定700多种口腔细菌,主要是由厚壁菌属、拟杆菌属、变形菌属、放线菌属、螺杆菌属和梭杆菌属组成[12]。在通常情况下,这些微生物是处于动态平衡状态的,对机体无害或者有益;但是当口腔微生物群落失衡时,就会引起一系列的口腔疾病,甚至是全身的一些系统性疾病。

因机体抵抗力下降,或长时间大剂量使用抗生素,应用免疫抑制剂等原因抑制了口腔的正常菌群,导致白血病患者的口腔菌群失调。许多研究表明口腔菌群与白血病患者口腔局部感染性疾病及全身感染均有关系。有研究发现部分AML患者在诱导化疗期间口腔微生物和胃肠道微生物多样性都显著性下降[13],而口腔菌群细菌门的特点是多样性本身较少[14-16],常见报道较为丰富的细菌门有Proteobacteria,Bacteroidetes,Actinobacteria和Fusobacteria[17]。本研究使用16S rRNA高通量测序技术并经物种注释发现排名前十的门分别是厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、梭菌门(Fusobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、螺旋体菌门(Saccharibacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和螺旋体门(Spirochaetes)。其中,厚壁菌门在ALL组中的丰度最高,Bacteroidetes在AML组中的丰度最高,变形菌门和放线菌门在ALL组中的丰度远低于其他两组。在恶性肿瘤研究表明Bacteroidetes结直肠中的丰度降低[18],Bacteroidetes可减少肠道炎症免疫反应,发挥对结肠炎的保护作用。然而本研究发现在急性白血病组中Bacteroidetes在AML中丰度增高。另外,有学者在口腔癌研究中发现Firmicutes在患者口腔中的丰度亦降低[17],此研究差异可能与不同疾病类型相关。

本研究发现链球菌属在ALL中的丰度最高,奈瑟氏菌属在AML组中的丰度远高于其他组,Abiotrophia在健康组中的丰度远低于其他组。ALL诱导化疗期间所接受的抗生素越多,诱导化疗后感染的风险越大。但是,在健康口腔菌群中,链球菌亦是最常见的优势属[19,20]。本研究发现奈瑟氏菌属在AML组中的丰度远高于其他组,而健康人口腔中低频率的奈瑟氏菌是维持控制个人口腔菌群的关键[13,20],说明奈瑟氏菌属可能是指示ALL患者健康状况的关键指标。

本研究中高通量测序分析结果中,健康组、AML组、ALL组的样品聚类情况较差,无法单独聚为一类,组间差异不明显,样品间相互交叉,这说明这几组样品间的相似性与组内样品相似性差别不大,且组内样品的个体差异大。后续研究需扩大样本量,以便更深入地了解急性白血病患者口腔微生物菌群的改变与口腔感染等并发症之间的关系。