肉毒毒素的研发及应用进展

靳令经， 潘丽珍

(同济大学附属同济医院神经内科，上海 200065)

肉毒毒素(botulinum toxin， BT)是由肉毒梭状芽孢杆菌在缺氧条件下产生的一种细菌外毒素，属于神经毒素，是已知最致命的物质之一。20世纪80年代，BT治疗斜视获得成功。近40年来，随着对其作用机制的深入了解以及对其生物学效应的精准把握，BT的临床应用领域不断拓展。目前，BT已成功应用于神经系统、消化系统、泌尿系统、美容整形、康复医学等多种领域，并正尝试用于顽固性疼痛、腺体过度分泌、雷诺综合征、抑郁症等病症的治疗。与此同时，不断有新型BT药物研发成功，为临床提供了多元化、个体化的选择。

1 肉毒毒素的结构及作用机制

1.1 BT的结构及分型

BT主要由肉毒神经毒素(botulinum neurotoxin， BoNT)及辅助蛋白(complexing proteins， CP)组成。BoNT相对分子质量为150000，由相对分子质量为50000的轻链(light chain， LC)及相对分子质量为100000的重链(heavy chain， HC)通过二硫键连接，成为有活性的双链。所有血清型BoNT都具有3个相对分子质量基本相同但功能不同的区域： HC的氨基端(相对分子质量为50000，HN)为易位区，HC的羧基端(相对分子质量为50000，HC)为受体结合区，LC为催化区域。CP主要由非毒素非血凝素(non-toxic non-hemagglutinin， NTNHA)及血凝素(hemagglutinin， HA)两部分构成[1-2]。BoNT是BT的活性成分。在BT自然口服条件下，CP可保护BoNT通过胃肠道的酸性环境并与肠道黏膜结合，进入生物体内。在临床注射途径下，在BT到达靶组织神经末梢突触前膜前，BoNT已经从复合物中解离，CP不仅无法发挥自然条件下的保护作用，反而存在刺激机体免疫系统产生抗体的风险[3]。

根据抗原性不同，BT分为不同血清型。目前已确认并广泛接受的自然产生的BT共有7种，按照字母顺序命名为BT/A～BT/G。2014年，曾有研究报道第8种血清型H(BT/H)[4]，但近期研究表明其与BT/A及BT/F有类似的结构并与BT/A具有相似的抗原性，故将其命名为BT/FA或BT/HA[5]。2017年，Zhang等[6]采用GenBank数据中肉毒杆菌菌株111的基因序列，通过基因组测序及生物信息学技术，得到一种新型BT蛋白序列，并与目前已知的BT无相同抗原性，暂时将其命名为BT/X，目前尚不清楚该菌株在自然条件下是否产生BT/X。每种血清型根据氨基酸序列的不同又分为不同的亚型。迄今为止，已经发现40余种不同的BT亚型。目前以BT/A应用范围最广。

1.2 BT的作用机制

BoNT通过HC受体结合区域与神经末梢特异性受体结合，形成内吞小体进入神经末梢胞质。内吞小体在ATP酶的作用下，易位区插入脂质双分子层形成细小通道，催化区即LC通过此通道进入神经末梢细胞质内。LC是一种锌钛链内切酶，可以水解可溶性N-乙基马来酰胺-敏感因子附着蛋白受体(soluble N-ethyl-maleimide-sensitive factor attachment protein receptor， SNARE)复合体，影响突触囊泡与突触前膜融合及神经递质的释放。

SNARE蛋白复合体是囊泡膜与神经末梢细胞膜结合的必要成分，包含3种蛋白： 突触相关膜蛋白(VAMP)、突触融合蛋白(syntaxin)和突触小体相关蛋白25(SNAP-25)。不同血清型的毒素，其水解的目标蛋白及位点亦不相同：
A、E型作用于SNAP-25，B、D、G、F型水解VAMP，C型可水解Syntaxin和SNAP-25。其中BoNT/A于SNAP-25 C端移除9个氨基酸残基，形成SNAP-251-197，而BoNT/E移除26个氨基酸残基形成SNAP-251-180。这些蛋白一旦被BoNT水解，含有乙酰胆碱等神经递质囊泡的释放将受到抑制，导致神经-肌肉信号传递障碍，达到化学性去神经支配的作用，引起骨骼肌迟缓性瘫痪及自主神经功能障碍。

尽管BT作用于神经末梢抑制神经递质的释放，但并未破坏神经细胞的结构及生理功能，随着神经末梢功能的逐渐恢复，其导致的神经瘫痪作用完全可逆。由于不同血清型BT在神经末梢所结合的特异性受体不同，水解的目标蛋白及位点不同，LC在细胞内被清除的时间不同，不同血清型的BT作用时间亦不尽相同。作用时间长短顺序为BT/A、BT/C、BT/B、BT/D、BT/F、BT/G、BT/E。在人类骨骼肌中，作用时间最长的BT/A为3～6个月；最短的为BT/E，作用时间<4周[7]。

1.3 BT的中枢作用及逆向转运

目前已经证实并被广泛接受的是： BT药物有效的治疗效果基于其对注射部位神经末梢递质释放的特异性高效抑制。但越来越多的研究表明BT对周围神经的作用难以解释所有的临床现象，提示中枢神经系统参与其中的可能。通过功能磁共振研究发现，卒中后偏侧肢体痉挛的患者，BT注射后其同侧及对侧大脑运动皮层活动减少，而且在运动皮层以外其他脑区如顶叶、枕叶皮层或小脑的区域激活模式亦有变化[8-9]；颈部肌张力障碍患者BT局部注射后，头颅磁共振可显示大脑皮层灰质信号及体积的改变，提示外周注射BT对大脑皮层结构及功能产生影响[10]。单侧眼轮匝肌、甲杓肌注射可引起对侧相应肌肉电生理信号的变化[11-12]；另外比目鱼肌注射可导致同侧远隔非注射肌肉股四头肌电生理信号改变[13]，提示局部肌内注射BT后可影响脊髓、脑干神经元功能。在含BT的孵育液细胞中可观测到BT的逆轴突运输；在动物实验中，局部注射BT后，可在脑干组织中发现被水解的SNAP-25[14-15]，提示BT或被水解的SNAP-25逆轴突转运的可能。但也有部分研究结果与此并不一致[16]，并且目前尚无直接证据表明，中枢神经系统结构及功能的改变与逆向轴突运输相关，或者与其注射后神经环路信号改变相关。BT对中枢的作用机制尚需进一步研究。

1.4 BT的免疫原性

BT中的BoNT及CP成分注射入人体后，作为异源性蛋白可刺激机体产生抗体。直接作用于BoNT成分并导致BT作用效能下降的抗体，被称为中和性抗体，可导致继发性治疗无应答；针对CP及其他非BoNT成分产生的抗体，被称为非中和性抗体，不影响BoNT的治疗效果，但可增加中和性抗体产生的风险[17]。

尽管目前临床中BT应用非常广泛，但其产生抗体并导致继发性无应答的概率很低。BT/B型药物由于注射剂量高于BT/A型，其产生抗体的可能性高于后者。目前报道BT/A产生抗体的概率为0%～3%，BT/B产生抗体的概率为10%～44%[18-19]。对BT/A产生继发性无应答的患者可给予BT/B型药物治疗。

2 基于作用机制的新型药物的研发

2.1 BT临床药物现状

1989年，美国食品药品监督管理局(FDA)首次批准BT药物——onabotulinumtoxinA(Botox®, 爱尔兰Allergan公司)上市，以后陆续有新的药物进入临床应用。目前有BT/A及BT/B被FDA批准作为药物应用于临床，其中BT/A除onabotulinumtoxinA外，还包括： abobotulinumtoxinA(Dysport®,法国Ipsen公司)及incobotulinumtoxinA(Xeomin®,德国Merz公司)，BT/B型药物有rimabotulinumtoxinB(Myobloc®,美国Solstice Neurosciences公司)。另外，我国自主研发生产的衡力®(lanbotulinumtoxinA，Lantox®，中国兰州生物制品研究所)在亚洲、拉丁美洲及东欧等地区的多个国家注册应用。我国目前仅有Botox®及Lantox®被批准用于临床。在临床使用的药物中，其组成除了BoNT及CP以外，还有与药物稳定性有关的赋形剂。不同产品赋形剂不同，如Botox®为人血白蛋白，Lanlox®为明胶。在随着对BT结构及作用机制研究的进一步深入，不同血清型、亚型及不同药物辅助成分的BT逐渐被研发，为临床提供更丰富的选择。

2.2 不同药物成分改变药物作用特征

IncobotulinumtoxinA仅含有BoNT活性成分而不含有CP，自2005年上市以来已在欧美国家得以广泛应用。其与onabotulinumtoxinA具有同等的临床疗效。而且由于无CP成分而降低了免疫原性，可减少继发性无应答的产生[20]。我国兰州生物制品研究所已研发出不含CP成分的BoNT/A——chinbotulinumtoxin。

另外一种正在研发的针对BT/A的药物daxi-botulinumtoxinA(RT002)，亦是纯化的BoNT，在冻干粉药物中含有专用的稳定辅料肽(RTP004)，不含CP及白蛋白或其他人或动物的血液成分，具有更高的稳定性及更低的免疫原性。Ⅱ期临床研究亦显示，daxibotulinumtoxinA在颈部肌张力障碍及眉间纹治疗中具有良好的耐受性及较长的作用时间[21-22]。

2.3 多种血清型药物的研发

BT/E与BT/A一样作用于SNAP-25，但BT/E与BT/A结合神经末梢的特异性受体不同，作用于SNAP-25的位点不同，其起效时间更快，作用时间更短。目前，新型BT/E型药物及重组BT/E药物正在研发，并且已分别进入Ⅰ、Ⅱ期临床试验阶段。其将应用于仅需要短期治疗效果的疾病，如骨折骨关节脱位后及术后瘢痕预防中期望短期抑制肌肉收缩时。

3 基于作用机制的临床应用拓展

3.1 BT药物的临床应用现状

目前，BT已广泛应用于临床疾病治疗及医学美容领域，适应证超过30个。2008年，美国神经病学会(American Academic of Neurology， AAN)发布了关于运动障碍、自主神经功能障碍、疼痛以及痉挛状态的BT治疗指南，通过对各项基于循证医学报道的证据进行分级及综合分析，形成各适应证的治疗推荐建议。2016年，AAN更新了BT/A在面肌痉挛、颈部肌张力障碍、成人痉挛状态及头痛的治疗指南及推荐级别，并首次对不同品牌的BT/A分别进行推荐，指导临床医生在准确评估的情况下进行超适应证治疗[23]。

在神经病学领域，BT用于治疗： (1) 肌张力障碍，尤其是局灶性肌张力障碍如眼睑痉挛、颈部肌张力障碍的一线治疗。(2) 非肌张力障碍性运动障碍，如偏侧面积痉挛、震颤、抽动症及磨牙症等。(3) 痉挛状态，如脑卒中、脊髓损伤及多发性硬化等疾病导致的痉挛状态，亦包括小儿脑瘫。在眼科用于斜视的治疗；在自主神经功能障碍领域，用于治疗多汗、流涎等；在泌尿学领域，BT局部注射用于神经源性逼尿肌过度活动症、膀胱过度活动症及逼尿肌-括约肌功能失调等；在疼痛治疗方面，慢性偏头痛已成为FDA批准的BT治疗适应证；在医学美容领域，用于减轻鱼尾纹、眉间纹及动力性额前纹等，也用于改善下面部皱纹及颈纹。

2018年，我国肉毒毒素治疗应用专家组及中华医学会神经病学分会帕金森病及运动障碍学组以国际BT/A临床应用的循证医学证据为基础，参考AAN的适应证推荐分级，结合中国专家长期应用肉毒毒素的治疗经验，共同制定了《中国肉毒毒素治疗应用专家共识》[24]。在此版本中，BT的适应证及推荐级别如表1。

表1 肉毒毒素的临床适应证及推荐级别

3.2 不断拓展的临床应用领域

在自主神经功能疾病治疗领域，除多汗、流涎等病症以外，有小样本研究显示BT局部注射对雷诺综合征治疗安全有效[25]。其机制可能与其抑制去甲肾上腺素的释放，调节血管平滑肌功能有关[26]。目前，同济大学附属同济医院正在进行一项单中心的随机双盲安慰剂对照研究(ChiCTR-1800015359)，以期获得更多循证医学证据。

慢性疼痛是临床工作中常见的一种综合征，严重影响患者的生活质量。BT治疗缓解疼痛的最初证据来源于在治疗肌肉过度紧张相关的疾病如肌张力障碍或痉挛状态时，其伴发的疼痛缓解。虽然肌肉松弛可能在一些情况下发挥作用，但越来越多的证据表明，它们不能解释BT治疗后缓解疼痛的所有机制。例如，在肌内注射BT的情况下，缓解疼痛的作用也可以先于肌肉松弛作用或持续更长时间。目前普遍认为，除了局部去神经支配以外，其轴突逆向运输或中枢作用也可能参与其中，但具体作用机制尚需进一步研究。

对慢性偏头痛，除了可预防偏头痛发作，减轻发作程度，长期治疗亦可明显改善患者的生活质量并且耐受性良好[27]。但对临床常见的紧张性头痛，基于目前开放性研究及随机双盲对照研究结果，并不推荐BT局部注射[23]。BT被尝试用于神经病理性疼痛如疱疹后神经痛、三叉神经痛、幻肢痛及糖尿病周围神经病等的治疗，小样本研究治疗有效[28]，尤其对高龄难治性三叉神经痛患者是良好的选择[29]。另外，对于慢性骨筋膜疼痛患者，BT治疗能够缓解疼痛症状，改善生活质量。

骨关节炎及相关性关节疼痛同样影响患者的生活质量，临床治疗目标是缓解疼痛及减少关节功能损伤。目前有限的临床研究采用安慰剂对照显示，膝关节内注射BT后评估疼痛缓解情况及关节功能改变的结果并不一致[30-31]。其治疗效果及作用机制有待于更多的循证医学研究。

在创伤修复过程中，局部组织代谢活动增加并伴发局部炎症反应，可导致创口边缘肌肉收缩，影响创面愈合并形成瘢痕。鉴于BT化学性去神经支配作用，通过在伤口附近局部注射BT，有助于伤口的整体愈合过程和改善愈合伤口的外观[32-33]。新型BT/E药物的研发，将更有利于该领域的应用。

此外，在其他领域，如贲门失弛缓症、糖尿病性胃瘫、前列腺增生、间质性膀胱炎等，BT均可改善患者症状；对抑郁症患者进行皱眉肌区域注射亦能取得良好治疗效果。这些仅限于小样本的临床实验或病例报道，为将来BT的应用提供更多的思路或可能。

4 展 望

BT是一种特异、高效的治疗性蛋白质，通过抑制神经肌肉及腺体的过度活跃而达到缓解症状的目的。随着生物学、基因组学、蛋白质组学等技术的进展，越来越多的BT被逐渐发现及利用，人们对其结构及作用机制的研究及认识将更加深入，从而为新型药物的研发提供基础。此外，在未来几年中，修饰和重组毒素将进一步扩展BT的应用前景。临床研究的快速发展及评估治疗手段的更加精准化，将有助于提高BT疗效，减少副反应发生，进一步拓展其临床应用范围，为更多的患者提供有效的、个体化的治疗。