Ac-SDKP对TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响

黄凤璋 覃玉花 梁鸣*

(1.广州医科大学附属市一人民医院肾内科; 2.广西医科大学第四附属医院风湿免疫科,广东 广州 510180)

肾小管间质纤维化常表现为小管萎缩和扩张、间质白细胞浸润、成纤维细胞聚集以及间质基质沉积等[1]。EMT是一种固有的上皮标记物丢失而获得间质特征的现象，可根据其发生的生物环境被细分为三类(1型、2型和3型)，其中2型EMT与纤维化有关，在肾脏中可以发生在肾小球的足细胞、壁层上皮细胞及肾小管上皮细胞内。TGF-β1已经被证明是EMT的最佳触发剂，也最强烈的致纤维化因子，其在肾小管上皮细胞内通过激活R-Smads通路诱导肾小管上皮细胞EMT[2]。Tβ4的降解产物Ac-SDKP已经证明能通过抑制 TGF-β1诱导的Smad2磷酸化发挥抗肾脏纤维化的作用，有研究指出Tβ4在硬化肾小球中表达升高[3].因此，为探究在肾脏纤维化中Ac-SDKP与Tβ4的关系。本实验通过检测TGF-β1刺激诱导体外大鼠肾小管上皮细胞发生EMT后Tβ4的表达及予不同浓度的Ac-SDKP共同作用后Tβ4表达的变化，进一步探讨Tβ4在肾小管上皮细胞发生EMT后的表达及Tβ4和Ac-SDKP的相互作用对EMT的影响，为阻断和逆转肾间质纤维化探寻新的、合理有效的方法寻找实验依据，为肾脏纤维化的药物治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1主要试剂 兔多克隆Tβ4抗体(abcam公司)；兔多克隆a-SMA抗体(北京博奥森生物有限公司)；重组人TGF-β1蛋白(广州佰浩生物技术有限公司)；Ac-SDKP(Abbiotec公司)；卡托普利(广州齐云生物科技有限公司)；兔EnVision二步法检测试剂盒(DAKO公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞的传代及药物刺激 往培养皿中加入胰蛋白酶溶液1ml，轻轻摇晃培养皿使所有细胞表面覆盖有消化液，1～2 min后，在显微镜下见细胞间隙增大，细胞变圆，吸走消化液终止消化。加入培养液，反复吹打细胞使细胞分开，脱落成为单细胞悬液，以2×105个/mL的密度种植于6孔板里，随机分为6组：①空白对照组，②TGF-β1(5 ng/mL)刺激组，③TGF-β1(5 ng/mL)+卡托普利(1 μmol/L)，④TGF-β1(5 ng/mL)+Ac-SDKP(0.1 nmol/L)+卡托普利(1 μmol/L)组，⑤TGF-β1(5 ng/mL)+Ac-SDKP(1 nmol/L)+卡托普利(1 μmol/L)组，⑥TGF-β1(5 ng/mL)+Ac-SDKP(10 nmol/L)+卡托普利(1μmol/L)，每组做三个复孔，培养48 h。加卡托普利为防止Ac-SDKP的降解。

1.2.2培养细胞的Envision免疫组化二步法实验步骤

1.2.2.1 细胞爬片 培养瓶中的细胞长到2×105个细胞/ ml 时，用胰蛋白酶消化制成细胞悬液；在灭菌的六孔板中每孔铺上一块盖玻片；取细胞悬液分别滴到玻片上，让细胞贴片30 min左右；然后在培养皿中补加完全培养液，放于37 ℃、5%CO2μmol/L培养箱中培养24 h；待细胞长到70%～80%后换不含血清的培养液继续培养24 h，使细胞处于G0期。

1.2.2.2 细胞免疫组化染色 取出细胞，PBS冲洗 5 min×3次→4%的多聚甲醛固定20 min；PBS冲洗 5 min×3次→0.3%的TritoonX-100通透20 min；PBS冲洗 5 min×3次→3%的过氧化氢孵育15 min；PBS冲洗 5 min×3次→分别加入一抗兔抗人Tβ4(1∶800)和兔抗人α-SMA(1∶100)，置于湿盒中4℃冰箱孵育过夜(14～16 h)；PBS冲洗5 min×3次→加DAKO ChemMate EnVision/HRP，Rabbit/Mouse (ENV) 二抗，置于 37 ℃温箱孵育30 min；取出细胞，PBS冲洗5 min×3次；加入DAKO公司的DAB显色液，现配现用，显微镜下观察，3 min后用自来水终止显色反应，自来水洗5min；苏木素复染细胞核2 min，自来水洗1 min；盐酸酒精分化5 s后用水洗2 min；温水2 min返蓝，风筒吹干，中性树胶封片，显微镜下观察结果。

1.2.3Tβ4和α-SMA细胞免疫组化染色结果的半定量分析 采用Image Pro-plus6.0病理图像分析系统,通过光学显微镜放大200倍摄取图像,输入图像分析系统内,对图像进行灰度变换,使阳性面积与背景分开,进行自动测量。需要测量每张照片选择区域的面积(area)与累积光密度(IOD),方法步骤如下：① 摄片,每张切片在200倍镜下选择6个不重复的视野。② 软件算出每张照片的IOD和area,之后对染成蓝色的细胞核计数，作为细胞数N，以OD=IOD/(N×area)作为免疫组化染色半定量指标。③ 计算同一实验组切片各照片OD值的平均值及标准误。④ 用统计学方法分析各实验组的OD值之间是否有显著性差异。

1.3 统计学分析

用IPP6.0图像分析软件计算出各组的OD值，数据结果用均数±标准误表示；组间均数比较前，经Levene检验总体方差，如方差齐选用方差分析，方差不齐选用近似t检验，P<0.05为差异有统计学意义；对有相关趋势的变量，采用Pearson相关分析，P<0.01为有差异统计学意义。所有数据由SPSS16.0统计软件进行分析处理。

2 结果

2.1 肾小管上皮细胞的形态改变

正常的大鼠肾小管上皮细胞成圆形或类圆形，呈鹅卵石样排列；TGF-β 1(5 ng/mL)刺激48h后细胞形态明显拉长，呈梭长形，似成纤维细胞；予Ac-SDKP干预后，浓度为0.1和1 nmol/L时，细胞形态未见明显变化，10 nmol/L时细胞形态似有恢复类圆形，但未达到正常的细胞形态。(见图1)

ABCDEF

A.空白对照组 B TGF-β1C TGF-β1+卡托普利 D TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(0.1 nmol/L) E TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(1 nmol/L) F TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(10 nmol/L)

图1 TGF-β 1(5 ng/mL)刺激肾小管上皮细胞48 h后细胞形态变化(光镜×400)

2.2 细胞免疫组化染色结果

2.2.1肾小管上皮细胞中Tβ4的表达变化 空白对照组细胞浆与细胞核内Tβ4呈弱阳性表达，OD值为(0.203±0.009)；TGFβ-1阳性对照组与空白对照组比较，肾小管上皮细胞胞浆及胞核内Tβ4的表达(褐色)明显增加，OD值为(0.346±0.016)，差异有统计学意义(P<0.05)；TGFβ-1+卡托普利组褐色稍有减少，但变化不明显，OD值为(0.337±0.021)，与TGF-β1阳性对照组比差异无统计学意义(P>0.05)；0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L Ac-SDKP+TGF-β1+卡托普利共同作用组与TGFβ-1阳性对照组比较，Tβ4表达均降低，10 nmol/L降低最显著，OD值分别为(0.321±0.013)、(0.297±0.018)、(0.237±0.008)，与TGF-β1阳性对照组比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)；0.1 nmol/L、1 nmol/L分别与10 nmol/L组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。(见图2、3)

2.2.2肾小管上皮细胞中α-SMA 的表达变化 空白对照组胞浆内α-SMA仅有微量表达，OD值为(0.184±0.007)；TGF-β1阳性对照组与空白对照组比较，肾小管上皮细胞胞浆内α-SMA的表达(褐色)明显增加，OD值为(0.345±0.008)，差异有统计学意义(P<0.05)；加入卡托普利后α-SMA的表达稍降低，但与TGF-β1阳性对照组相比下降不明显，OD值为(0.334±0.023) ，与TGF-β1阳性对照组比差异无统计学意义(P>0.05)；0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L Ac-SDKP+TGF-β1+卡托普利共同作用组与TGF-β1阳性对照组比较，α-SMA表达均降低，10 nmol/L降低最显著，OD值分别为(0.312±0.015)、(0.304±0.016 )、(0.225±0.018)，与TGFβ1阳性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；0.1 nmol/L、1 nmol/L组分别与10 nmol/L组比较，差异均有统计学差异(P<0.05)。(见图4、5)

ABCDEF

A.空白对照组；B.TGF-β1;C.TGF-β1+卡托普利;D.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(0.1 nmol/L);E.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(1 nmol/L); F.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(10 nmol/L)

图2 免疫组化染色显示TGF-β 1单独作用及与不同浓度Ac-SDKP共同作用48 h后大鼠肾小管上皮细胞Tβ4的表达(×400)

A.空白对照组;B.TGF-β1;C.TGF-β1+卡托普利;D.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(0.1 nmol/L);E.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(1 nmol/L);F.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(10 nmol/L)

图3 各组细胞Tβ4免疫组化染色的半定量分析

ABCDEF

A.空白对照组;B.TGF-β1;C.TGF-β1+卡托普利;D.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(0.1 nmol/L);E.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(1 nmol/L);F.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(10 nmol/L)

图4 免疫组化染色显示TGF-β 1单独作用及与不同浓度Ac-SDKP共同作用48 h后大鼠肾小管上皮细胞α-SMA的表达(×400)

A.空白对照组;B.TGF-β1;C.TGF-β1+卡托普利;D.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(0.1 nmol/L);E.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(1 nmol/L);F.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(10 nmol/L)

图5 各组细胞a-SMA免疫组化染色的半定量分析

2.2.3Tβ4和α-SMA在TGFβ-1刺激大鼠肾小管上皮细胞EMT后表达量的相关性分析 Tβ4和α-SMA在肾小管上皮细胞的表达存在直线正相关关系且差异具有计学意义(r=0.995，P<0.01)。(见图6)

0.3500.3000.2500.2000.150α-SMA阳性信号的平均OD值0.2100.2400.2700.3000.330Tβ4阳性信号的平均OD值RSqLinear=0.99

图6 Tβ4和 α-SMA在TGF-β1诱导大鼠肾小管上皮细胞EMT后表达量的相关分析

3 讨论

纤维化是慢性肾脏疾病进展的一个关键因素，EMT在成熟组织纤维化期间成纤维细胞的发生过程中起重要作用，来自于肾脏纤维化的研究证据表明，有超过三分之一的成纤维细胞起源于肾小管上皮细胞[2]。细胞极性消失和细胞间紧密连接消失、上皮细胞的表型标志物E-钙粘素的表达下调，并表达波形纤维蛋白、α-SMA、成纤维细胞特异蛋白1(Fibroblast-specific proteinl,FSP1)，是肾小管上皮细胞转分化的标志。

Hong KO等[4]通过体外培养的口腔鳞癌细胞证明过表达Tβ4可使E-钙粘素表达下调和波形纤维蛋白表达上调，据此推测Tβ4是口腔鳞癌中EMT样表型的重要调节者。Tβ4是由44个氨基酸残基组成的结构高度保守的水溶性酸性多肽，是β胸腺肽家族中含量最高的成员，被认为是人的血小板内主要的球形肌动蛋白(G-肌动蛋白)结合肽[5]。Tβ4经过两步水解反应最终释放Ac-SDKP，而Ac-SDKP几乎唯一的被血管紧张素转换酶水解[6]。在一些体内实验和临床试验中证明，Ac-SDKP能够阻止高血压和慢性肾脏病中胶原蛋白的合成[7]及逆转心肌梗死后心脏的炎症和纤维化[8]。在一些体外研究中，Ac-SDKP已经被证明能够抑制肾脏成纤维细胞的增生、阻止肾髓质纤维化[9]和抑制心脏成纤维细胞增殖、胶原蛋白的产生[10]。但是Ac-SDKP对体外肾小管上皮细胞的作用的研究尚未见报道。

本实验中予TGF-β1刺激后，大鼠肾小管上皮细胞发生形态改变，细胞由类圆形变成梭形，同时α-SMA的表达也上调，提示肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞。在正常的肾小管上皮细胞内Tβ4呈弱阳性表达，α-SMA仅有微量的表达，TGF-β1刺激后，Tβ4和α-SMA的表达均显著增加，证实在TGF-β1(5 ng/mL)时可诱导肾小管上皮细胞出现EMT；加入卡托普利与TGF-β1共同作用后，Tβ4和α-SMA的表达与TGF-β1刺激后诱导Tβ4和α-SMA的表达量相比变化不大，提示虽然卡托普利部分是通过抑制Ac-SDKP的降解而发挥抗肾脏纤维化的作用，但内源性Ac-SDKP的浓度不足以达到抗纤维化的效应，通过加入外源性Ac-SDKP，Tβ4和α-SMA的表达下降，浓度为10 nmol/L时抑制作用最强，与TGF-β1刺激组相比均差异有统计学意义，与Hongmei Peng等[11]所报道的相符。Tβ4随Ac-SDKP浓度的增加而下调，10 nmol/L时Tβ4降低最显著，推测Ac-SDKP通过影响Tβ4的表达，进而影响Tβ4介导肾小管上皮细胞EMT，Ac-SDKP通过何种机制调节Tβ4的表达尚不能确定。相关性分析发现Tβ4和α-SMA之间存在直线正相关关系，提示Ac-SDKP的发现可以为抗纤维化药物的研究提供新的方向，可通过抑制Tβ4的表达，从而抑制EMT，也许是治疗肾间质纤维化的一个新途径。