人参皂苷Rh1对TMAO诱导的HUVECs凋亡的保护作用的研究

陈绮映，林超，杨荣丰，黄荣，王丽丽*

(1.中国医学科学院阜外医院深圳医院心内科，广东 深圳 518000； 2.中山大学附属第七医院儿科，广东 深圳 518000)

内皮细胞的功能损伤、死亡，被认为是动脉粥样硬化 ( AS) 发病的早期关键性环节[1]。内皮细胞的死亡方式有两种，凋亡和坏死。动脉粥样硬化的各种致病因素如：吸烟、肥胖、高血压、高血糖、高血脂等均可引起内皮细胞凋亡。近年来的许多研究也已经证实内皮细胞凋亡是AS病变的主要特征之一，并在AS的形成和发展中起了重要的作用[2，3]。

近年来关于肠道菌群与疾病的相关性研究不断涌现，肠道菌群在人类健康中的作用也越来越得到人们关注。随着对肠道菌群研究的逐步深入，发现肠道菌群及其代谢产物TMAO可能通过促进AS的发生发展，成为心血管疾病的又一危险因素[4，5]。然而目前，关于TMAO与内皮细胞凋亡的研究较少，TMAO促进AS的发生，是否与内皮细胞凋亡有关，目前尚未得知。

现已发现的人参皂苷单体众多，其中人参皂苷Rh1是备受关注的单体之一。研究表现人参皂苷Rh1可促进内皮细胞增殖，提高细胞活性[6]。然而人参皂苷Rh1究竟是通过什么方式发挥内皮细胞保护作用，目前仍未定论。与此同时，研究发现人参皂苷Rh1可抑制乳腺癌细胞的凋亡[7]。然而，目前尚未有关于人参皂苷Rh1与内皮细胞凋亡的研究。本研究以 TMAO诱导人脐静脉内皮细胞凋亡为模型，探讨人参皂苷的保护作用，为保护血管内皮功能和防治开辟新途径。

1 材料与方法

1.1 材料,试剂与主要仪器

人脐静脉内皮细胞购于中国科学院上海生命科学研究院提供，TMAO购于Sigma公司，人参皂苷Rh1购于成都瑞芬思生物科技有限公司，EDU细胞增殖试剂盒购于锐博生物科技公司，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于碧云天生物技术公司，ECM培养基购于北京裕恒丰科技有限公司，其配套的内皮生长因子胎牛血清购于Invitrogen-Gibco公司，DMEM 培养基购于Gibco 公司，流式细胞检测采用B D的FACSVerse流式细胞仪进行检测，细胞荧光的检测采用日本的olympus显微镜，Caspase-3抗体购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 EDU增殖实验

内皮细胞的增殖采用EDU增殖实验进行检测。内皮细胞消化后，按照4 ×103个/孔的细胞量传到96孔板中。实验分为对照组、TMAO组、人参皂苷Rh1组、TMAO+人参皂苷Rh1组。TMAO组加入100 μmol/L的TMAO{GuoHua Ma}，人参皂苷Rh1组加入200 μmol/L的人参皂苷Rh1( Wonhwa Lee，)，TMAO+人参皂苷Rh1组在加入100 μmol/L的TMAO的同时加入的200 μmol/L人参皂苷Rh1。细胞贴壁后加入刺激因素，处理24 h，加入EDU染色反应液。继续培养6 h后，弃培养液，PBS清洗细胞1～2次，每次5min。每孔加入4%的多聚甲醛固定30min，之后用2 mg/ml甘氨酸脱色摇床孵育5 min。PBS清洗3次后，加入0.5 %TritonX-100的PBS，脱色摇床孵育10 min。各组加入EDU染色反应液，避光，室温脱色摇床孵育30 min。用含0.5 % TritonX-100的PBS清洗3次后，进行DAPI染色封片。之后在荧光显微镜下面观察 细胞增殖的状态。

1.3 流式细胞学实验

细胞分组同前,内皮细胞在加入刺激因素后，继续培养48 h，之后用胰酶消化后，1 000 转离心5 min。弃上清，每组加入195ul Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。之后加入5ul Annexin V-FITC，轻轻混匀。室温避光孵育10 min后，离心，弃上清。加入1905ul Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，最后加入10 μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，进行流式细胞学检测。

1.4 Western-blot实验

细胞分组同前，内皮细胞在加入刺激因素后，继续培养48 h，之后用胰酶消化收集细胞。细胞用细胞裂解液裂解，收集蛋白。凝胶电泳和转膜后加入caspase-3的一抗，37 ℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶偶联的二抗，孵育2 h，0.01 mol/L PBS洗膜，5 min×4次。加入显色液,避光显色。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 人参皂苷Rh1降低TMAO对HUVECs细胞增殖的抑制作用

如图1显示，相对于对照组，TMAO可以显著抑制内皮细胞的增殖(P<0.05)。单独的人参皂苷Rh1对内皮细胞的增殖没有显著的影响，但是人参皂苷Rh1的加入可以扭转TMAO对HUVECs细胞增殖的抑制作用，相对于TMAO组增殖率明显升高(P<0.05)，见图1。

合成DAPIEDU对照RhqTMAOTMAO+Rh1

图1 人参皂苷Rh1削弱TMAO对内皮细胞增殖抑制的作用

2.2 人参皂苷Rh1抑制TMAO上调的HUVECs凋亡相关基因caspase-3的蛋白表达

如图2所示，Western-blot实验结果显示TMAO可以上调HUVECs凋亡相关基因caspase-3的蛋白表达(P<0.05)。当加入人参皂苷Rh1后，可以发现这种上调作用受到了抑制(P<0.05)。

2.3 人参皂苷Rh1对TMAO诱导的HUVECs凋亡起保护作用

流式细胞检测的结果显示TMAO可以诱导HUVECs凋亡，凋亡细胞的比例明显增加 (P<0.01)。单独人参皂苷Rh1对内皮细胞的凋亡没有显著的影响，但是可以抑制TMAO引起的内皮细胞的凋亡 ，凋亡的细胞数相对于TMAO组明显降低(P<0.01)。见 图3。

1234Caspase-3GAPDH

图2 人参皂苷Rh1削弱TMAO上调内皮细胞Caspase-3蛋白表达的作用

TMAO+Rh1TMAORh1对照组

图3 人参皂苷Rh1削弱TMAO诱导的内皮细胞凋亡的作用

3 讨论

动脉粥样硬化是一种慢性的、多种致病因素作用下诱发的血管疾病，是发展中国家心血管事件死亡的主要原因。内皮损伤及功能紊乱被认为是动脉粥样硬化的始动环节[8]。研究发现，凋亡内皮细胞可导致内皮功能障碍，并诱发动脉粥样硬化斑块破裂和血栓形成，对动脉粥样硬化的发生和发展有着重要的意义[9-10]。因此，寻找新的延缓内皮细胞凋亡的生物因子或机制，可为防治动脉粥样硬化提供新的靶点。

肠道菌群与动脉粥样硬化疾病的关系研究，是近年来的研究热点。TMAO作为肠道菌群在人体的主要代谢产物，已被证明与动脉粥样硬化疾病的发生和发展密切相关[11-12]。 我们的研究发现，TMAO干预的HUVECs出现细胞增殖下降、凋亡上调的情况，再次验证了TMAO诱导内皮细胞凋亡的作用。

人参皂苷是传统中药人参中的主要有效成分，被证实有多种生理作用。截至目前，已有超过40种人参皂苷单体从人参中分离提取出来，其中含量较高主要有Rb1、Rg1、Rh1等。其中，人参皂苷Rh1可发挥广泛的生理效应，如：抗炎、抗氧化应激、免疫调节、内皮保护等。我们的研究发现，人参皂苷Rh1可对抗TMAO诱导的内皮细胞凋亡，并促进内皮细胞增殖。这就提示，人参皂苷Rh1可能通过对抗TMAO诱导的内皮细胞凋亡，发挥内皮保护作用。然而，人参皂苷Rh1的内皮细胞凋亡的保护作用的具体机制，尚有待进一步研究。我们会在后续的研究中，从分子机制的层面展开探究，并在动物实验层面上验证。本研究为此提供了思路。

综上所述，我们的研究表明，人参皂苷Rh1可对抗TMAO诱导的HUVECs凋亡，继而发挥内皮保护作用。