地黄不同工艺炮制过程中主要活性成分的变化规律研究

沈丽琴，杨 晗，李胜华，高 羽，徐 翔，胡浩武，周青罡

(江西汇仁药业股份有限公司，江西 南昌 330052)

回顾历代本草文献，熟地黄炮制方法各异，有蒸法、酒煮法、酒炖法、姜制法、砂仁制法及制炭等，但是蒸法始终是各个时期地黄炮制的主流，蒸法有单蒸、加酒蒸和“九蒸九晒”[1]，其中单蒸被《中国药典》2015年版定为法定方法，这种方法的关键在于对蒸制温度和蒸制时间的控制。但历版《中国药典》以及各省市地方炮制规范中关于熟地黄的蒸制工艺均无明确工艺参数，且炮制程度的判断主要靠手摸、目测、品尝等感官分析，要求“黑润，断面乌黑色，有光泽，味甜”，这种宽范围的感官标准主观性较强，判断结果因人而异，容易导致熟地黄的质量参差不齐，严重影响临床疗效[2]，因此亟待建立一个熟地黄炮制终点的量化判定标准。而对于熟地黄的炮制，须判断采用哪种蒸制工艺效果最佳。众所周知，“九蒸九晒”是不少本草古籍记载的熟地黄传统炮制方法，很多老药工也提倡要“九蒸九晒”。一般认为，“九蒸九晒”熟地黄，其性滋而不凝，补而不腻，疗效远胜过一般熟地黄。但是“九蒸九晒”有工艺繁琐、消耗燃料多、生产周期长、费时费力等缺点，不适合大规模工业化生产的要求。目前有关熟地黄炮制研究的报道较多[3-7]，但对传统“九蒸九晒”炮制工艺和现代大生产常压一次蒸制工艺的比较研究还较少。因此，本实验以梓醇、毛蕊花糖苷、地黄苷A、5-羟甲基糠醛(5-HMF)和葡萄糖等熟地黄中代表性成分的含量为指标，对传统“九蒸九晒”法与现代常压一次蒸制法炮制过程中的成分变化规律进行研究，并比较两者差异，为以传统“九蒸九晒”熟地黄为参照来优选熟地黄现代炮制工艺研究提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪；AG135型十万分之一电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；AB204-S型万分之一电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；DC200H超声波清洗机(三角洲超音波有限公司)。

1.2 材料

本研究所用生地黄产地为河南，经鉴定为玄参科地黄属植物地黄RehmanniaglutinosaLibosch.的块根；对照品梓醇(批号：110808-201711)、毛蕊花糖苷(批号：11530-201713)、5-羟甲基糠醛(批号：111626-201711)和D-无水葡萄糖(批号：110833-201707)均购于中国食品药品检定研究院；地黄苷(成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：D083-170728)。甲醇和乙腈为色谱纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 熟地黄炮制品制备

2.1.1 常压一次蒸制熟地黄 取生地黄，洗净，分别蒸制2、4、6、8、12、16 h。稍晾干，拌回蒸液。置干燥箱内，80 ℃干燥，干燥至八成干不粘刀为准。干燥后的熟地黄进行切制，切药长度为15 mm。切制好的熟地黄最后进行第2次干燥，干燥条件同上。分别留样分析。

2.1.2 九蒸九晒熟地黄 取生地黄，洗净，蒸制3 h，再焖制1 h。稍晾干，拌回蒸液。置干燥箱内，80 ℃干燥，干燥至八成干不粘刀为准。干燥后的熟地黄进行切制，切药长度为15 mm。切制好的熟地黄最后进行第2次干燥，干燥条件同上，即得一蒸一晒熟地黄，反复蒸制9次，每次留样分析。

2.2 梓醇、毛蕊花糖苷的含量测定

梓醇的含量测定方法参照2015版《中国药典》“地黄含量测定”项下梓醇的测定方法[8]。毛蕊花糖苷的含量测定方法参照2015版《中国药典》“熟地黄含量测定”项下毛蕊花糖苷的测定方法[8]，结果见表1和表2。

2.3 地黄苷A的含量测定

参考相关文献报道所用的方法[9]。供试品溶液的制备：取各批次熟地黄样品粉碎过20目筛，取0.5 g置于50 mL量瓶中，加甲醇定容，置于室温下冷浸过夜后超声提取1.5 h，冷却至室温，补足减少的质量，滤过，取续滤液25 mL，蒸干，残渣用15%甲醇溶解，定容至5 mL。用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒定质量的地黄苷A对照品12.0 mg，加甲醇定容至20 mL，制成含地黄苷A 600 μg/mL的对照品溶液。

色谱条件：色谱柱为安捷伦Zorbax Extend-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，体积流量为1 mL/min，柱温为25 ℃。流动相为乙腈-0.1%磷酸水(3∶97)，检测波长为203 nm。

线性关系考察：将对照品分别配成地黄苷A质量浓度12、24、60、120和600 μg/mL的溶液。按上述色谱条件各进样10 μL，测定峰面积。将所得峰面积积分值与各对照品的质量浓度进行线性回归，得回归方程、相关系数(r)及线性范围分别为：y=3.694 3x-9.988 1，r=0.999 9。

样品定量测定：取各供试品溶液，依法进行测定，结果见表1和表2。

2.4 5-羟甲基糠醛的含量测定

参考相关文献报道所用的方法[9]。供试品溶液的制备：制法同测定地黄苷A的方法。

对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒定质量的5-羟甲基糠醛对照品适量，加甲醇定容至10 mL。制成含5-羟甲基糠醛1 001.95 μg/mL的对照品溶液。

色谱条件：色谱柱为ZORBAX Extend-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，体积流量为1 mL/min，柱温为25 ℃。流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液(11∶89)，检测波长为284 nm。

线性关系考察：取对照品溶液分别配成质量浓度为0.40、1.00、10.02、40.08和201.60 μg/mL的溶液，各进样10 μL，测定峰面积，将峰面积与5-HMF质量浓度进行线性回归，得回归方程：y=86.414x+85.009，r=0.999 8。

样品定量测定：取各供试品溶液，依法进行测定，结果见表1和表2。

2.5 葡萄糖的含量测定

参考相关文献报道所用的方法[9]。供试品溶液的制备：取各批次熟地黄样品各1 g，置锥形瓶中，加入20 mL蒸馏水，超声提取2 h，冷却至室温，补足减失的质量，置于离心管中离心，倾出上清液，置于PE管中待用。量取待用液1 mL定容至10 mL。用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

对照品溶液制备：精密称取干燥至恒定质量的无水葡萄糖对照品适量，加1%乙腈水定容至5 mL。制成含无水葡萄糖1.466 63 mg/mL的对照品溶液。

色谱条件：色谱柱为Accurasil NH2柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水(72∶28)体积流量1 mL/min，柱温25 ℃，检测器为ELSD，Alltech2000ES，漂移管温度93 ℃，气体体积流量2.6 L/min。色谱图见图6。

线性关系考察：参考相关文献报道所用的方法[9]。取对照品溶液，分别配成葡萄糖质量浓度为0.07、0.15、0.29、0.44和1.47 mg/mL的溶液。各进样10 μL，测定峰面积，将峰面积的对数与质量浓度的对数进行线性回归，得回归方程：y=1 722.1x-45.327，r=0.999 6。

样品定量测定：取各供试品溶液，依法进行测定，结果见表1和表2。

表1 熟地黄常压一次蒸制工艺样品成分测定结果 (mg/g)

注：扣除水分。

表2 熟地黄“九蒸九晒”工艺样品成分测定结果 (mg/g)

注：扣除水分。

2.6 结果分析

图1 梓醇液相色谱(对照品、生地黄、熟地黄)

图2 地黄苷A液相色谱(对照品、生地黄、熟地黄)

图3 毛蕊花糖苷液相色谱(对照品、生地黄、熟地黄)

图4 毛蕊花糖苷液相色谱(对照品、生地黄、熟地黄)

图5 葡萄糖液相色谱(对照品、生地黄、熟地黄)

在常压一次蒸制过程中，随蒸制时间的延长，梓醇的含量下降极其明显，与生品相比，蒸制2 h时其含量约降低60%；在2～4 h，含量略有升高；4 h之后，含量又缓慢下降，到16 h时其含量较生品约降低74%。地黄苷A的含量在加热蒸制2 h前，有一定的下降，2 h后含量变化不大，经炮制后下降幅度为20%～38%。毛蕊花糖苷的含量经加热蒸制后，在2 h时较生品含量有一个急剧的下降，下降幅度约为80%；在2～4 h时，含量下降幅度降低；4 h以后随蒸制时间的延长，其含量变化不大，趋于稳定，最终下降幅度约为85%；在蒸制16 h后，其含量测定也能达到2015版药典对熟地黄毛蕊花糖苷含量的要求(不能低于0.2 mg/kg)。糖热降解产物5-HMF在蒸制过程中表现为随蒸制时间增加含量也相应增加，6 h之前，含量升高幅度不大；之后升高幅度逐渐增加，12 h含量最高；到16 h时，含量略有下降，可能是由于5-HMF 的分解和蒸制过程中的水气蒸发也会带走少量的5-HMF。而葡萄糖在加热炮制过程中，其含量逐渐升高，到16 h后，增加3.5倍，之后还有再增加的趋势。

在“九蒸九晒”不同蒸晒次数时，梓醇的含量随着蒸晒次数的增加而逐渐减小，到第8次蒸晒含量变化趋于稳定，第9次蒸晒其含量极低，较生品下降约97%。地黄苷A的含量变化趋势与梓醇类似，第9次蒸晒时较生品下降约72%。毛蕊花糖苷的含量也是随着蒸晒次数的增加而逐渐减小，不过到第4次蒸晒之后，含量降低的幅度趋缓，第9次蒸晒时含量较生品下降约92%。5-HMF的含量随着蒸晒次数的增加而逐渐增加，其中第1～6次蒸晒过程中，含量明显增加，到第7次趋于平稳，第9次其含量达到了2.76 mg/g。葡萄糖的含量随蒸晒次数的增加而略有增加，到第3次时含量最高，增加幅度较生品高约2.1倍，随后含量略有下降，第9次蒸晒含量较生品增加约1.5倍。

3 讨论

本实验制备的“九蒸九晒”熟地黄，通过各成分含量测定结果可以看出，经九制后梓醇、地黄苷A和毛蕊花糖苷的含量，分别较生品下降约97%、72%和92%；5-HMF经九制后含量达到2.76 mg/g；葡萄糖较生品增加了约1.5倍。而常压一次蒸制16 h后，熟地黄中梓醇、地黄苷A、毛蕊花糖苷的含量分别较生品下降约74%、28%、86%，5-HMF含量为0.27 mg/g。两者相比，常压一次蒸制16h熟地黄与“九蒸九晒”熟地黄在主要成分含量上还是有很大差异，说明现代常压一次蒸制工艺很难达到“九蒸九晒”工艺的炮制程度。传统中医药学认为“九蒸九晒”熟地黄疗效比较好，但“九蒸九晒”工艺不适合工业化生产，而现代企业在中药炮制中，已经越来越多的采用高压蒸制法，因为高压蒸制法有明显缩短炮制时间、提高生产效率和节约生产成本等优点。前期我们在对不同干燥温度的熟地黄样品的研究中，发现随着干燥温度的增加，熟地黄中各成分含量的变化速度会加快(尤其是梓醇和5-HMF)。而在高压蒸制时蒸制温度通常可达到130 ℃以上，在如此高的温度下可以加快成分之间的变化，也就是通过短时间的高压蒸制也可达到“九蒸九晒”的炮制程度。后续我们将以“九蒸九晒”熟地黄为参照标准，在大规模生产的情况下进行高压蒸制工艺的研究。

5-HMF是很多中药及其炮制品中存在的一种成分，其对光、温度和空气敏感，当在高温条件下时，药材中的葡萄糖、果糖等单糖化合物发生麦拉德反应，脱水生成了5-HMF[10]，有研究表明加热时间和温度是影响5-HMF的首要因素[11]。通过对常压一次蒸制和“九蒸九晒”的工艺研究，我们发现随着炮制程度的加深，5-HMF的含量也在逐渐增加，其量的增加与炮制程度密切相关，因此可以考虑将5-HMF作为一个评价熟地黄炮制程度的辅助质量指标。