丙酮酸脱氢酶激酶在恶性肿瘤中的研究进展*

王秋月，贾方 综述，王菊勇审校，

200032 上海，上海中医药大学附属龙华医院 肿瘤研究所

人体正常细胞所需的能量来源主要在于葡萄糖代谢，根据组织中氧分压的充足与否，分为线粒体的氧化磷酸化和有氧糖酵解，此外，糖代谢还包括戊糖磷酸途径。在氧气充足的情况下，细胞大多会将葡萄糖转化为丙酮酸后进入线粒体进行氧化磷酸化，生成CO2和H2O及较多的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)。但在20世纪20年代，奥托·瓦伯格发现肿瘤细胞的有氧糖酵解率远大于正常细胞，即使在氧气充足的情况下，肿瘤细胞也更喜欢通过有氧糖酵解途径产生ATP，并非线粒体的氧化磷酸化[1],即所谓的 “Warburg效应”。“Warburg效应”为肿瘤细胞的生长提供了两大优势：一是为肿瘤细胞的快速繁殖提供了大量碳源；二是关闭氧化通路，避免氧自由基的产生，逃避细胞凋亡[2]。目前对于糖酵解相关酶的研究较多，丙酮酸脱氢酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinases,PDKs)作为丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase,PDH)的调控酶，在糖酵解中占有重要地位，因此本文主要从PDKs在肿瘤糖酵解中的功能特点、肿瘤相关调控通路及调节蛋白、与肿瘤临床特点的相关性及相关肿瘤抑制剂研究等4方面阐述其在肿瘤发生发展中的作用及临床意义。

PDKs为丙酮酸脱氢酶复合物(pyruvate dehydrogenase complexes PDCs)的调节酶，共有PDK1、PDK2、PDK3和PDK4四种亚型。PDK1主要存在于心脏和胰腺,PDK2几乎在所有的组织中表达，尤其是肝脏和肾脏,PDK3大部分存在于睾丸中,对抑制剂分子的敏感性最低，PDK4在骨骼肌、心脏和肝脏中少量存在[3]。其中PDK1被认为与肿瘤发生、转移密切相关，在体外研究中发现其对PDH-E1α丝氨酸残基232的磷酸化也是不可或缺的[4]。

1 PDKs在恶性肿瘤糖酵解中调节的酶及竞争酶

PDKs是葡萄糖代谢途径中的关键酶，能够促使丙酮酸、乳酸和丙氨酸进行糖异生。PDK1在糖酵解中发挥重要作用，在许多癌症中表达上调，促进Warburg效应和肿瘤的生长[5]，受PDK1蛋白调节的PDH是丙酮酸脱羧氧化生成乙酰辅酶A并进入线粒体三羧酸循环和脂质生物合成的门控酶，在葡萄糖代谢中起关键作用。PDH是PDCs的重要组成部分，主要有3种催化酶、1个附加结构组成，包括丙酮酸脱羧酶、二氢硫辛酸转乙酰化酶、二氢硫辛酸脱氢酶和二氢硫辛酸脱氢酶结合蛋白[6]。其中E1具有三个磷酸化位点(ser232,ser293,ser300)[7]，而每个位点磷酸化的速率随着PDKs的亚型的不同而不同[8]。PDKs介导的磷酸化能够抑制PDH的活性，减少丙酮酸的脱羧氧化以调节癌细胞对氧的供需平衡，促进癌细胞的生长及抑制死亡[9]。

Yang等[10]指出是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)突变的非小细胞肺癌患者服用靶向药会导致PDK1的升高，增加PDH磷酸化，抑制PDH的活性，从而抑制肿瘤细胞线粒体内的三羧酸循环，促进其Warburg 效应，而缺氧条件下EGFR靶向药与PDK1抑制剂的联合使用可以增强抗肿瘤效果。但也有研究显示在EOL-1、MDA-MB 435、PC3和DU 145细胞中，PDH-E1α的磷酸化可能依赖于PDK1蛋白的表达水平，并非PDK1的酪氨酸磷酸化，在这些细胞中丙酮酸脱氢酶磷酸酶(pyruvate dehydrogenase phosphatase，PDP)活性相对较低，或者是PDK1以外的PDK亚型与这些细胞中的PDH-E1α磷酸化有关[11]。除此之外，Sun 等[12]研究证实PDK4的表达在一定程度上阻止转化生长因子β诱导的上皮间充质转变(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。相反，抑制PDK4则能诱导与厄洛替尼耐药相关的EMT，研究其机制发现是PDK4与细胞凋亡诱导因子相互结合，调节EMT相关蛋白表达，促进厄洛替尼耐药和活性氧的产生。

与PDK1竞争性调节PDH的酶为PDPs，目前对PDPs与癌症关系的认识尚不成熟，尚未发现某些药物可作用于PDP亚型进行靶点研究[13]。PDPs主要包括PDP1(负责催化和调节亚基)和PDP2(仅有催化作用),二者均负责PDH三个位点的去磷酸化[14-15]。PDK1促进PDH-E1α的磷酸化，导致PDCs活性降低，而PDPs负责PDH-E1α的去磷酸化。因此，两者的相对活性决定了 PDC 复合物的活性[16]。

2 PDKs在恶性肿瘤相关通路及调控蛋白的研究

肿瘤细胞中普遍存在缺氧现象，其主要原因是邻近血管的血液供应不能满足肿瘤的生长所需，也可能是由于异常新形成的肿瘤血管中的血流波动所致[17]。肿瘤缺氧导致缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)表达增多，PI3K信号通路也可调节HIF-1表达，从而调控PDK1促进PDH磷酸化的增加，使PDC活性降低，促进癌细胞的有氧糖酵解[18]。此外即使在缺乏缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1 α，HIF-1α)的情况下，PDK1的过度表达仍能激活糖酵解[19]，表明PDK1的升高独立于HIF-1α。Pate等[20]研究表明PDK1的表达还受Wnt信号的调节，在结肠癌细胞中通过干扰Wnt/β-catenin信号传导，发现PDK1表达降低，细胞糖酵解过程受到抑制，抑制肿瘤发展。PDK4则受Ras信号传导的调节，Ras信号传导参与糖酵解、线粒体呼吸和谷氨酰胺的代谢途径。Trinidad等[21]在Kras突变的肺癌细胞中发现PDK4的缺失导致Kras活性降低，定位细胞膜的能力下降，MAPK信号降低，发挥抑制肿瘤细胞生长的作用，而PDK4的稳定表达增加了活化Kras在质膜上的定位，在体外和体内诱导肿瘤细胞生长，并指出Kras突变细胞对PDK4具有依赖性。

研究证明microRNA的失调与恶性肿瘤的发生发展密切相关，与PDKs相关酶的调控作用不尽相同。研究表明多种miRNA与胃癌侵袭转移密切相关[22]，胃癌细胞中microRNA-422A表达与肿瘤大小和浸润深度呈负相关，mir-422A过表达能够抑制PDK2的表达，增加细胞的氧化磷酸化，抑制胃癌细胞的复制和转移；此外，mir-422A-PDK2轴影响脂肪及活性氧(reactive oxygen species,ROS)的形成，降低Rb磷酸化水平，诱导癌细胞周期停滞[23]。肺癌细胞中microRNA-182过表达则能够抑制PDK4的表达，导致PDH活性升高，促进肺癌细胞的增殖和集落形成，并指出mir-182过表达或者PDK4敲除同样影响癌细胞的脂质形成[24]。

癌基因(c-Myc)和雌激素相关受体(estrogen-related receptors，ERRS)对PDKs的高表达也产生影响。c-Myc作为致癌基因，在多种恶性肿瘤中高度活化，其编码的转录因子参与调控细胞的增殖分化和凋亡等多种生物学过程，并且与肿瘤的糖代谢密切相关。c-Myc与HIF-1联合作用促进PDK1转录，增加葡萄糖转运体及乳酸脱氢酶等的表达，促进有氧糖酵解[25]。而ERRS除了能够增强HIF-1和c-Myc有氧糖酵解的作用外，还能够通过上调PDK4抑制氧化代谢[26-27]。此外，线粒体上致癌酪氨酸激酶成纤维细胞生长因子受体1能够磷酸化并激活PDK1的多个酪氨酸磷酸化位点，诱导其与ATP和PDC的结合，从而促进肿瘤细胞代谢及生长[11]。

抑癌基因p53可以抑制PDK2的表达，从而增加丙酮酸进入线粒体，促进氧化呼吸,并发现在不同的组织和细胞中及可用碳源的不同，p53下调PDK2的机制不同。在肌肉中，p53似乎通过上调细胞色素氧化酶缺陷同源物2活性降低乙酰辅酶A，使PDK2失活；在肝脏中，p53上调谷氨酰胺酶-2，将谷氨酰胺转化为柠檬酸循环中间体α-酮戊二酸来加速柠檬酸循环抑制PDK2的活性[28](图1)。

图1 PDKs和相关蛋白的信号通路Figure 1. Signaling Pathway of Pyruvate Dehydrogenase Kinases and Related ProteinsPyruvate dehydrogenase kinases (PDKs) is regulated by C-myc and estrogen-related receptors. C-Myc, which is regulated by growth factors through Ras/MEK/ERK signaling pathway, can regulate lactate dehydrogenase A activity to promote lactate production. PDKs that inhibit the activity of pyruvate dehydrogenase enzyme activity to promote aerobic glycolysis of tumor cells is modulated by hypoxia inducible factor-1 α which is influenced by PI3K signaling pathway and hypoxia conditions. In addition, PDKs expression can be inhibited by p53 tumor suppressor gene and many microRNAs, but Wnt signaling pathway can promote it.

3 PDKs与恶性肿瘤临床特点及耐药机制研究

不同恶性肿瘤中，PDKs亚型的表达水平不同，Liu等[29]在非小细胞肺癌患者组织标本中发现PDK1表达较高，并与肿瘤T分期呈正相关，T分期越高，PDK1表达水平越高，而过度表达PDK1会促进癌细胞的增殖和抑制凋亡，增加癌细胞迁移率，并指出PDK1是非小细胞肺癌独立的预后因素。Lu等[30]研究显示PDK1在结肠癌组织表达较低，而PDK3表达较高，并且PDK3的表达与HIF-1α的表达、肿瘤的严重程度呈正相关，与无病生存期呈负相关。在卵巢癌中PDK1的高表达能够激活EGFR，与顺铂耐药及淋巴结转移明显相关，而抑制PDK1的表达则能够诱导耐药细胞死亡，逆转卵巢癌细胞的EMT，并通过生存分析指出PDK1的高表达与患者预后较差密切相关[31-32]。

PDK2是糖酵解和线粒体氧化磷酸化重要的调节因子，其在多种肿瘤组织中表达增加。Sun等[33]研究发现下调PDK2能够提高耐药肺癌细胞对紫杉醇的敏感性，该敏感度的增加与糖酵解减少有关，但并不代表氧化磷酸化的增加，并指出紫杉醇诱导PDK2的表达是肺癌细胞获得性紫杉醇耐药的重要机制。同样，肿瘤细胞在缺氧条件下也会促进PDK3的表达，PDK3能够抑制细胞的凋亡并增加细胞对顺铂或紫杉醇的耐药性，而敲除PDK3能够抑制缺氧诱导的糖酵解，提高肿瘤细胞对顺铂、紫杉醇、奥沙利铂等抗癌药物的敏感性[34]。非小细胞肺癌患者常以铂类为基础进行化疗治疗，然而，顺铂的使用受到其副作用的限制，特别是肾小管损伤相关的肾毒性[35]。Oh等[36]研究发现PDK4的表达与顺铂诱导的肾小管损伤明显相关，抑制PDK4表达后能够降低线粒体活性氧生成和减少脂肪酸氧化，减轻顺铂对肾小管的损伤。此外，抑制PDK4的表达还能增加膀胱癌对顺铂的敏感度，诱导肿瘤细胞死亡[37]。

4 PDKs抑制剂的相关研究

PDKs在肿瘤组织中的高表达与肿瘤中异常糖酵解密切相关，尤其是PDK1，它是唯一一个能够磷酸化E1三个磷酸化位点的激酶[38]。因此，抑制PDKs(主要是PDK1)可作为抗肿瘤治疗的新靶点[39]。关于PDKs抑制剂的研究较多，主要包括四类[40]，一是丙酮酸类似物，如二氯乙酸脂；二是作用于PDKs二硫辛酸口袋的化合物,如CPI6I3、Nov3r及AZD7545等；三是属于ATP竞争型抑制剂,如Radicicol、M77976等,上述抑制剂因具有抗癌疗效时剂量过大或者选择性抑制较差等造成毒副作用较大等问题，限制其在临床上的应用；第4类PDK的共价抑制剂JX06，作用于PDKs半胱氨酸附近的结合口袋，对其进行共价修饰，通过改变PDK1构象，降低其对ATP的亲和力，从而能有效抑制PDK1激酶活性[41]，此类共价抑制剂有望成为恶性肿瘤PDK1抑制剂研发的候选者。Yang等[42]通过化学库的虚拟配体的筛选以及通过酶法验证其活性，发现6、7和11号化合物对PDK的抑制作用较强，在缺氧条件下，7和11号化合物能够抑制NCI-H1975细胞增殖。此外，研究证明随着PDKs抑制剂作用机制的不同，其代谢产物也不相同[43]。

随着中药单体药理学研究的发展，部分中草药单体能够通过有效抑制PDK1活性而起抗肿瘤作用。Lee等[44]发现肉桂皮的水提取物主要是肉桂酸能够抑制PDKs，提高线粒体的氧化磷酸化，增加ROS的生成，降低乳酸的产生，破坏线粒体膜的稳定性，并且通过ROS和线粒体依赖的凋亡途径诱导细胞死亡，同时对正常支气管上皮细胞的细胞毒性较小。在小鼠肺癌(Lewis lung carcinoma cells，LLC)细胞中，草玉梅有效成分在不影响PDK1表达的情况下，通过抑制PDK1的活性，降低PDHa的磷酸化，增加活性氧的产生及诱导线粒体的损伤[45]。在卵巢癌细胞中，紫云英苷能够抑制PDK1、PDK3的表达，并能激活线粒体介导的凋亡通路促进细胞凋亡[46]。虎杖苷A同样可以抑制PDKs的活性，降低人乳腺癌、肝细胞癌、结肠癌和小鼠LLC等癌细胞株的细胞活力[47]。Goniothalamin是番荔枝科植物中的抗癌活性成分，在黑色素瘤细胞中，可以通过降低PDK1、AKT的磷酸化起到抗增殖和诱导凋亡的抗癌功效[48]。

综上所述，PDKs在恶性肿瘤的发生发展中占有重要地位，其表达的高低对患者临床预后的评估具有一定的指导意义，对PDKs抑制剂的研究也取得一定的进展。但大多数癌细胞并不单纯依赖糖酵解产生能量，它们可协调三羧酸循环及磷酸戊糖等其他代谢途径满足自身生存需求[49]，因此，对糖酵解中其他酶进行筛选和确定以及发现及研发更多的酶抑制剂，进行多靶点的联合治疗才能更好地控制肿瘤。

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