金纳米棒光热治疗肿瘤的生物安全性评估*

王浩 综述，张世文 审校

650118 昆明，昆明医科大学第三附属医院·云南省肿瘤医院 头颈外一科

近年来，随着纳米医学科技不断发展，新型纳米材料应用于临床研究受到广泛关注[1]。金纳米棒因具有高效的光热转换特性和良好的生物相容性等独特的理化特性，已在免疫检测、细胞成像、基因运载以及肿瘤治疗等领域深入研究，具有广阔的生物医学应用前景[2-3]。作为一种新型的高效光热转换贵金属纳米材料，金纳米棒具有宏观金属粒子所不具备的物理性质。金纳米微粒本身的毒理性质以及制备过程中所用到的毒性化学物质，使金纳米棒的生物安全性成为临床应用研究要解决的首要问题之一。国内外研究显示，将一些正常物质制成纳米级后，可能会产生潜在的生物毒性[2-3]。因此，在医学应用相关研究中，系统性评估金纳米棒的生物安全性显得至关重要。

1 金纳米棒的理化特性和修饰

现代纳米技术可制备不同尺寸大小及不同形貌的金纳米棒。不同大小、形貌的金纳米材料的理化特性是不一样的。金纳米棒(gold nanorods，AuNRs or GNRs)在透射电镜下的结构示一种纳米级别的棒状金纳米颗粒(图 1A)[4]，其物理和化学性质非常稳定，具有表面等离子震荡特性，即当金纳米棒长横比为3.9时，其纵向最大光吸收峰位为800nm(图 1B),波长为800nm的近红外激光照射金纳米棒可以引起该微粒表层导带电子发生相干最大震荡。金纳米棒有两个表面等离子共振带，横向带在可见光区λ=520nm处，而纵向带在很宽的近红外光波长范围内[5-6]，只要纵横比发生微小的变化，金纳米棒的纵向带的吸收波长就会发生剧烈变化。纵向模式的共振如果发生在近红外光谱700～900nm的波长范围内，能够在生物组织中具有最大穿透深度，以及最高细胞摄取效率[7]。与其他纳米材料相比，金纳米棒的细胞毒性相对低[8]，可以通过Au-硫醇键与药物等聚合，从而轻松实现功能化。利用其易于修饰的特性，可以将药物和生物分子结合到金纳米棒上输送到身体的特定部位[9]。多项研究证明，金纳米棒在众多纳米材料(金纳米壳、金纳米球、金纳米笼等)中光热转换效率最高[10]。目前金纳米棒最主要的合成法为种子生长法，以十六烷基三甲基溴化铵(cetyl-trimethyl ammonium bromide，CTAB)分子作为表面活性剂。CTAB在金纳米棒的表面形成双层有机膜，其阳性季铵基团之间相互排斥使得金纳米棒在水性介质中相对稳定、分散，然而，CTAB包裹的金纳米棒在磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)和血清中却不稳定[11]，且有很明显的生物毒性[12]，这种现象大大地限制了金纳米棒在生物医学领域中的应用。另外，CTAB还会阻碍生物相容性好的化合物对金纳米棒表面的修饰作用[13]。解决问题的思路是替代CTAB或对其进行包被。替代CTAB的方法有：将CTAB从金纳米棒悬浮液中置换到含有磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)的氯仿溶液中[14]。与CTAB-AuNRs相比，PC修饰的金纳米棒细胞毒性较低，或是使用逐层聚电解质沉积作为增强金纳米棒表面稳定性的手段，而非CTAB[15]。Huang等[16]发现后者在PBS和血清中表现出优异的稳定性，保持了光学性质。烷硫醇对金具有高亲和力，也可用于替代CTAB分子[17]。Wang等[18]通过双相转移配体交换，用11-巯基十一烷酸置换金纳米棒表面的CTAB分子。作者认为，相对于CTAB-AuNRs，11-巯基十一烷酸-金纳米棒用于心肌肌钙蛋白I测定的阳性参考值下限降低了5倍，从而大大提高了灵敏度。另外，金纳米棒还可与磷脂-葡聚糖缀合，缀合后的金纳米棒在多个pH值的溶液和血清中均表现出很好的稳定性。另一种替代方案是在CTAB的基础上，再包被其他表面物质，例如用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)硫醇化CTAB，PEG涂覆的金纳米棒已广泛用于生物学应用。有研究表明PEG可以延长纳米材料在生物体内的循环时间[19]。PEG通过将硫醇接头锚定在金纳米棒表面，可以让金纳米棒更易功能化，可以结合肽、蛋白质、抗体、寡糖、核酸等多种生物分子[20]。与这些物质结合后的金纳米粒子能满足不同类型肿瘤诊断和治疗的需要，从而形成围绕金纳米棒的多平台肿瘤诊治体系[21-22]。目前金纳米棒的功能化修饰是研究其在生物体内主动靶向的方法之一，方法是使用肽或抗体等小分子化合物来修饰金纳米棒，使其能特异性地结合到高表达亲和性配体的肿瘤组织或细胞。有学者发现，与抗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)抗体结合的金纳米棒可靶向结合到高表达EGFR的膀胱癌细胞，借此可对膀胱癌进行靶向光热消融[23]。Zhang等[24]发现抗EGFR抗体缀合的金纳米棒(抗EGFR-GNS)对目前临床上预后很差的三阴性乳腺癌有较为理想的抑制作用，抗EGFR-GNS 介导的光热治疗显著诱导溶酶体自噬，最终导致高表达EGFR的乳腺癌细胞死亡。因此，通过对金纳米棒表面进行修饰与功能化，大大降低其毒性，进而为其广泛应用于生物医学领域提供重要基础。

2 金纳米棒的细胞毒性

金纳米粒子粒径在10～100nm的范围内,能够自由穿越细胞，在膜蛋白指导下通过内吞效应进入细胞中，在细胞外分泌下排出。金纳米粒子在细胞中的迁移速率与其粒径存在联系，粒径越小，毒性越大，迁移效率越快，并且金纳米粒子能够穿过细胞膜进入特定的细胞器中，干扰细胞器功能发挥，因此金纳米粒子具有潜在细胞毒性。Patra等[25]研究表明，5nm的金纳米微粒可以促进肺癌A549细胞凋亡，抑制肺癌A549细胞增殖。而直径10nm和20nm的金纳米微粒并没有出现明显的细胞毒性。Coradeghini等[26]研究表明,当浓度≥50μmol/L时，5nm的金纳米粒子会显现出对Balb/3T3的细胞毒性，而15nm的金纳米粒子却没有显现。球形1.4nm的金纳米粒子通过氧化应激机制导致肿瘤细胞中的线粒体损伤甚至出现坏死[27]。Pan等[28]研究发现直径1.4nm的金纳米微粒对结缔组织中的成纤维细胞、上皮细胞、巨噬细胞和黑色素瘤细胞的细胞毒性最为明显，可导致细胞快速死亡，而直径15nm的金纳米微粒即使在高浓度下也是无毒的。Connor等[29]研究也发现，直径18nm的金纳米粒子进入细胞内并不会对细胞产生毒性。由此可见，金纳米微粒的细胞毒性与其粒径有关，直径越小，细胞毒性越大。因此，金纳米粒子的尺寸不同，与细胞相互作用的行为也会产生差异。从一定程度上而言，细胞毒性与其浓度呈正相关。有研究学者利用金纳米棒对肺腺癌细胞进行转染分析[30]，通过在96孔板中进行肺腺癌细胞的培养，加入不同浓度的金纳米棒溶液后，利用MTT方法检测培养24、48、72小时之后的细胞毒性，结果表明金纳米棒浓度越高，细胞安全性越低。当金纳米棒的浓度在100ppm时，在24小时内对细胞有良好的生物安全性。随浓度升高，细胞存活率降低，随时间增长其细胞的存活率也会显著降低。当其浓度较高时会使细胞出现凋亡。有研究学者通过配体交换的方法，在金纳米微粒表面引入了羟基、羧基以及甲基，分别制备三种不同表面修饰功能团的金纳米微粒，其平均粒径为15nm，电位均为负值，通过MTT方法比较修饰后和未经修饰金纳米微粒作用HeLa细胞和MCC-803细胞之后的细胞存活率[31]。结果显示，当金纳米微粒浓度达到197ng/mL时，表现为低细胞毒性。从细胞周期结果来看，没有经过修饰的金纳米微粒对细胞G2/M周期活动具有一定的影响。在生殖毒性方面，根据Wiwantitkit[32]等的研究，化学衍生的金纳米粒子使雄性生殖细胞的运动活力降低。Taylor等[33]同样报道了暴露于激光作用下的修饰后的金纳米微粒使雄性生殖细胞的运动活力降低。综上所述，可以认为金纳米棒的尺寸及浓度均会影响细胞增殖，尺寸越小，浓度越高，细胞毒性越大。同时，金纳米棒表面修饰物的不同对细胞毒性也会产生影响。

图1 金纳米棒结构透射电镜图及吸收光谱图Figure 1. Transmission Electron Microscope and Absorption Spectra of Gold NanorodsA. Transmission electron microscope of gold nanorods; B. The near-infrared laser with a wavelength of 800 nm illuminates the gold nanorods, which can cause the coherent maximum oscillation of surface-conduction electrons of particles.

3 金纳米棒体内代谢与安全性

研究发现，不同大小、形貌的金纳米材料在生物体内的分布、代谢过程和毒性也不尽相同[34]。金纳米棒在体内吸收、分布以及积累的生物效应与其长径比、表面电荷分布情况、表面积有一定联系。当金纳米棒接触细胞或者蛋白时，纳米微粒表面会与蛋白质发生物化反应，形成生物-纳米界面，进而导致金纳米棒的理化性质发生较大变化。在临床上将金纳米棒经外周静脉注射到血液中时，血液中复杂蛋白复合物会在纳米微粒表面形成蛋白层，进而被血液中具有高结合率以及高浓度的蛋白包裹形成蛋白冠。蛋白冠会改变原有的金纳米棒大小及其表面构成，影响纳米金微粒的吸收和运输。为更准确分析金纳米棒在体内的分布代谢情况，研究学者选取四种不同表面修饰的长径比为3.8的金纳米棒，并以小鼠作为研究对象，通过一次性尾静脉注射的方式使小鼠染毒，选择几个不同时间点，观察小鼠体内肾脏、肝脏以及脾脏组织形态变化以及有关生化指标变化。结果发现，有70%的金纳米棒位于小鼠的肝脏中。少量金纳米棒分布于脾脏、肺脏、肾脏和脑。金纳米棒分布以及代谢器官主要在肝脏和脾脏。过量的金纳米棒会影响机体肝脏功能，CTAB-AuNRs对于小鼠肝脏产生的损害最为严重，其毒性主要在CTAB这一结构中，而有蛋白冠包裹的纳米微粒则具有良好的生物相容性。当CTAB-AuNRs进入肝脏后主要聚集在肝巨噬细胞的溶酶体中，引起机体氧化应激和炎症反应，进而使小鼠机体初期形成脂质过氧化，之后恢复正常。从病理学和氧化损伤指标可以看出，除CTAB-AuNRs组的其他组中，研究都们都发现组织毒性效应，可能是金等惰性金属材料诱导的细胞自噬[35]，进一步导致小鼠体内炎症[36]和细胞凋亡[37]。Sonavane等[38]研究发现，15～50nm直径的金纳米可以穿透小鼠血-脑屏障进入脑组织并蓄积。Lasagna-Reeves等[39]研究同样发现金纳米在低浓度的情况下依然能透过小鼠的血脑屏障，增加了神经元毒性损伤的风险。还有研究报道，金纳米微粒对生殖有一定毒性。用氨基化聚乙二醇修饰的金纳米注射到小鼠体内能够引起睾酮的分泌，但不会影响小鼠的生育能力，而甲氧基聚乙二醇修饰的金纳米既不影响小鼠睾酮的分泌能力，也不会影响小鼠的生育能力[40]。上述结果表明，金纳米棒在体内分布及代谢器官主要在肝脏及脾脏中，会对肝脏造成损伤，引起轻微的毒性。虽然金纳米棒分布在脑组织中含量较低，但依旧会透过血脑屏障，造成神经元的损伤。而在生殖方面，目前并没有发现明显的生殖毒性。

4 总结与展望

金纳米棒在生物医学研究中广泛应用。可以尝试将不同类型的技术(譬如细胞成像、药物运载和光热治疗)整合到一套纳米平台上，达到诊断与治疗的整合并用。虽然我们看到金纳米棒展现出广泛的应用前景，但如果将其应用到临床医学研究中仍然会有很多问题值得去探索。如何安全有效地利用金纳米棒进行疾病诊断和治疗，是我们科研工作者一直追求的目标。随着纳米科技的进步，对金纳米材料复合物或纳米载体进行无毒化处理，将有利于我们开发出更多基于金纳米微粒的诊断和治疗方法，造福人类。

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